6蛋白質(zhì)離子交換層析,蛋白質(zhì)紫外

1、實驗六 蛋白質(zhì)技術(shù)離子交換層析濃縮蛋白質(zhì)溶液紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度離子交換層析濃縮蛋白質(zhì)溶液基本概念 層析法是一種基于被分離物質(zhì)理化和生物學(xué)特性的不同（吸附力、分子量、電荷性質(zhì)、溶解度、親和力），使其在某種介質(zhì)中移動的速度不同而進行分離和分析的方法。溶有葉綠素的乙醚碳酸鈣粉末黃色的色帶（葉黃素）綠色的色帶（-胡蘿卜素）繼續(xù)洗脫，分段收集，就可以使葉黃素和-胡蘿卜素分離一個 經(jīng)典的層析實驗葉綠素的層析分離色譜法基本概念固定相是層析的一個基質(zhì)固體（吸附劑、凝膠、離子交換劑）液體（固定在硅膠或纖維素上的溶液）能與待分離物進行可逆的吸附、溶解、交換等作用阻力：阻止所分離的樣品向前移動流動相推動固

2、定相上待分離的物質(zhì)朝一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等。洗脫時所用的溶劑，也叫洗脫液。動力：不斷地前移，并帶動所分離的樣品向前移動分配系數(shù)（K）在一定條件下，某種組分在固定相和流動相中濃度的比值被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)、固定相和流動相的性質(zhì)、層析柱的溫度洗脫用洗脫液沖洗層析柱，使樣品中不同組分得以分離的過程。洗脫曲線以洗脫的體積為橫坐標(biāo)，組分的濃度為縱坐標(biāo)作圖所得的曲線。(二)層析法分類1.根據(jù)分離原理： 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析。2.根據(jù)流動相不同：液相層析（液-液層析，液-固層析）、氣相層析（氣-液層析，氣-固層析）3.根據(jù)支持物方式：柱層析、紙層析、薄層層析、高

3、效液相層析離子交換層析根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進行分離固定相：離子交換劑人工交聯(lián)的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠離子交換層析柱常用的陽離子交換纖維素（本身陰離子）有: 磺酸甲基纖維素(SMC) 羧甲基纖維素(CMC) 磷酸基纖維素(PC)常用的陰離子交換纖維素（本身陽離子）有: 二乙基胺乙基纖維素(DEAEC) 三乙基胺乙基纖維素(TEAEC)離子交換層析基本原理123451. 平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2. 吸附階段：樣品與反離子進行交換3、 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強吸附物質(zhì)4. 再生階段：用原始平衡液進行充分

4、洗滌，既可重復(fù)使用平衡液的反離子樣品溶液洗脫液（梯度濃度） 蛋白質(zhì)的等電點一般低于8，在pH為8的弱離子強度溶液帶負電荷，可以被陰離子交換樹脂吸附。當(dāng)增加緩沖液離子強度或陰離子電負性時，可以將蛋白質(zhì)成批量洗脫下來，達到蛋白質(zhì)濃縮的目的。試劑:待濃縮樣品：低濃度蛋白質(zhì)溶液陰離子交換樹脂纖維素DE-52（DEAE Cellulose DE-52 ） 預(yù)溶脹微粒, 為中等堿性陰離子交換劑 上樣緩沖液低離子強度緩沖液： 0.02 M 磷酸緩沖液 - 0.02 M NaCl （ pH8.0）洗脫緩沖液高離子強度緩沖液： 0.02 M 磷酸緩沖液 - 1 M NaCl （ pH8.0） 實驗操作及注意事項

5、 預(yù)裝層析柱（注意：不要干柱） 柱的平衡 用10ml的上樣緩沖液過柱 濃縮前蛋白質(zhì)濃度的測定 取待濃縮的蛋白質(zhì)溶液在分光光度計上測定蛋白質(zhì)的OD280 和OD260值 上樣 加入低濃度蛋白質(zhì)溶液（保護膠面,讓樣品全部進入樹脂中。 平衡（洗雜質(zhì)） 用20ml的上樣緩沖液流過柱子。 洗脫 用20ml洗脫緩沖液過柱，回收蛋白。（收集4管，每管3ml） 測定蛋白濃度 在收集的過程中測定每管溶液的OD280和OD260讀數(shù)，選取濃度最高管為濃縮蛋白計算濃縮倍數(shù)蛋白質(zhì)含量的測定 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度的原理原理：酪氨酸、色氨酸的苯環(huán)共軛雙鍵，OD280優(yōu)點：簡單、快速、樣品可以回收缺點：有一定的誤差（酪氨酸、色氨酸含量差異）受核酸類物質(zhì)干擾注意： 在紫外光下檢測，使用石英杯實驗操作與結(jié)果分析 在280nm和260nm兩處波長分別測得光密度值、再按下列公式計算。 OD值大于1的稀釋5倍再測 1、OD280OD2601.5時，用Lowry-Kalokar公式： 樣本蛋白質(zhì)含量(mgm1) 1.5OD2800.75OD2602、OD280OD2601.5時，用Lamb