豬肉品質(zhì)遺傳改良研究進(jìn)展

1、豬肉品質(zhì)遺傳改良研究進(jìn)展 李 學(xué) 偉四川農(nóng)業(yè)大學(xué)肉質(zhì)性狀復(fù)雜的綜合性狀 理化特性：肉色、pH值、系 水 率、嫩度、大理石紋、化學(xué)成分組織學(xué)特性：肌纖維密度、肌纖維直徑、結(jié)締組織含量風(fēng)味：滋味、香味、異味程度 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值：不飽和脂肪酸含量 、膽固醇含量豬肉品質(zhì)亟待改良長(zhǎng)期對(duì)生長(zhǎng)速度和產(chǎn)肉量的高強(qiáng)度選育，導(dǎo)致豬肉品質(zhì)急劇下降。本課題組近年來(lái)在豬肉品質(zhì)遺傳改良方面開展了大量研究。產(chǎn)肉量大幅提高與此同時(shí)肌內(nèi)脂肪含量減少1%左右甚至更低產(chǎn)生大量PSE肉灰白（pale）滲水（exudative）柔軟（soft）嫩度降低口感變差風(fēng)味變差豬肉產(chǎn)業(yè)遭受巨大損失肉質(zhì)性狀評(píng)價(jià)體系研究豬肉嫩度分析嫩度是肉類食物口感愜意

2、程度的綜合指標(biāo)，是肉食最重要的食用品質(zhì)之一。 Enfalt等（1997 ）研究發(fā)現(xiàn)豬肉嫩度與消費(fèi)者對(duì)豬肉制品的接受度有很高的相關(guān)性（r=0.81） 78%的法國(guó)消費(fèi)者認(rèn)為嫩度是決定其消費(fèi)的一個(gè)重要因素。Van Oeckel ，1999國(guó)產(chǎn)剪切力儀肉的嫩度包括硬度、彈性、多汁性、油脂程度等多方面的含義，是人咀嚼過(guò)程中，肉制品施與口腔的各種反作用力的綜合感官體現(xiàn)。 目前普遍的標(biāo)準(zhǔn)是用模擬牙齒咬斷肉樣的最大剪切力來(lái)代表嫩度，但這顯然是不全面的。嫩度分析系統(tǒng)利用物性測(cè)試儀加載各種探頭，模擬人口腔對(duì)肉制品的咀嚼動(dòng)作，實(shí)時(shí)收集力量變化。較傳統(tǒng)的只能測(cè)定最大剪切力的嫩度計(jì)更為客觀和精確。TAXT2i Tex

3、ture AnalyserStable Micro System Ltd, UK 嫩度分析沃布氏剪切沿肌纖維方向鉆取肉樣樣品水浴加熱到中心溫度70沃布氏刀具剪切實(shí)驗(yàn)最大剪切力平均剪切力硬度值剪切肌纖維方向取樣器=12.7mm嫩度分析Texture Profile Analysis收集到彈性，韌性，脆性、硬度等多項(xiàng)數(shù)據(jù)補(bǔ)充了大量剪切實(shí)驗(yàn)所不能收集到的數(shù)據(jù)柱狀探頭或星形探頭往復(fù)兩次壓縮樣品壓縮硬度粘性彈性 . . .肉質(zhì)分析感官評(píng)定感官評(píng)定是用于測(cè)量和分析樣品通過(guò)視覺(jué)、嗅覺(jué)、觸覺(jué)、味覺(jué)等所引起反應(yīng)的一種科學(xué)方法。世界各大標(biāo)準(zhǔn)組織均制定有詳盡、全面的感官評(píng)定方法。06-07年在肉制品領(lǐng)域權(quán)威期刊Me

4、at Science 上發(fā)表的涉及到感官評(píng)定的文章有44篇。參考ISO感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)和Onega與Ruiz de Huidobro （1999）報(bào)道的肉類感官測(cè)定評(píng)分法，對(duì)樣品的硬度、彈性、多汁性和風(fēng)味進(jìn)行評(píng)分。 采用感官評(píng)定能收集到那些無(wú)法采用儀器測(cè)定的肉質(zhì)性狀，如風(fēng)味等。通過(guò)感官評(píng)定能分析消費(fèi)者對(duì)肉質(zhì)性狀的喜好趨勢(shì)，從而用于確定選種方向。肉質(zhì)分析感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)食物組織學(xué)特性分析計(jì)算機(jī)圖像分析顯微圖像采集。計(jì)算機(jī)圖像分析。比傳統(tǒng)方法更為精確，收集性狀數(shù)據(jù)更全面。肌纖維直徑肌纖維面積肌纖維密度結(jié)締組織比例利用基因芯片構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并篩選候選基因的研究基因表達(dá)分析技術(shù)傳統(tǒng) vs.高通量Northe

5、rnQRT-PCRMicroarraySAGEMegasortGenecalling后基因組時(shí)代Post-genomic era 質(zhì)量性狀（主效基因） 數(shù)量性狀（微效多基因）系統(tǒng)整體的研究需要效率基因芯片高通量篩選肉質(zhì)候選基因可能影響的性狀基因數(shù)目 脂肪生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝 83個(gè) 骨骼肌生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝35個(gè) 肉 色5個(gè) 嫩 度16個(gè) pH 值34個(gè) 胴體生長(zhǎng)和發(fā)育32個(gè) 鮮味和膻味6個(gè)包含140個(gè)與豬脂肪沉積、代謝和肌肉生長(zhǎng)密切相關(guān)基因Qiagen-Operon（德國(guó)）Oligo功能分類芯片RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit（Qiagen, Germany） RNea

6、sy Lipid Tissue Mini Kit（Qiagen, Germany） RNA提取 cRNA標(biāo)記 1%瓊脂糖凝膠電泳 (初步質(zhì)檢)定量檢測(cè) (Agilent2100 Bioanalyzer ) Pronto Universal Hybridization Kit (Corning, USA) 雜交 TaKaRa Spaced Cover Glass（Takara, Japan） 42,12-14 hScanArray4000(PE,USA)532 nm (Cy3) 635 nm (Cy5) 掃描 引自：Butte A.The use and analysis of microarr

7、ay data. Nat Rev Drug Discov. 2002 ,1(12):951-60. 基因芯片試驗(yàn)流程品種間（相同月齡） 月齡（T）RNA pool連續(xù)時(shí)間點(diǎn)間（品種內(nèi)） 月齡（T+1） 背最長(zhǎng)?。↙ongissimus dorsi muscle ）背部皮下脂肪（Backfat）Landrace 23Month 14243Month 1Taihu pig 5518張15張 2 3 1Month 0Month 0 4 2 4 3 1 5 5Taihu pigLandrace長(zhǎng)白豬（Landrace）太湖豬（Taihu pig）RNA pool vsvs選擇瘦肉型的長(zhǎng)白豬和脂肪型的太

8、湖豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基因芯片實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出一些重要節(jié)點(diǎn)上的基因。進(jìn)一步根據(jù)其已知的生理功能和現(xiàn)有文獻(xiàn)確定了一批候選基因進(jìn)行單獨(dú)分析。動(dòng)態(tài)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型DBN model基因芯片基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Discretization Threshold= 2 SD (standard deviation) 由于基因信息的不完整性和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的隨機(jī)性，利用不同數(shù)據(jù)構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不完全一致所篩選到的這些基因在網(wǎng)絡(luò)中的位置和調(diào)控關(guān)系有一定變化。因此更需要將其獨(dú)立出來(lái)加以深入研究基因芯片基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)肉質(zhì)性狀候選基因研究組織蛋白酶B（CTSB） 溶酶體組織蛋白酶B（Cathepsin B、C

9、TSB）是肌肉中重要的內(nèi)源蛋白酶。采用RT-PCR結(jié)合克隆測(cè)序的方法，克隆出了豬CTSB基因的mRNA序列。全長(zhǎng)1 919 bp，包括完整的CDS區(qū)和3端非編碼序列 。Markercds1184 bpMarker3 RACE1008 bp3 RACE 產(chǎn)物電泳圖Cds區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖mRNA序列紅框表示起始密碼子和終止密碼子 豎線表示預(yù)測(cè)外顯子分界點(diǎn) 克隆測(cè)序組織蛋白酶B（CTSB） Cds區(qū)長(zhǎng)度1008bp，編碼一個(gè)335殘基的肽段。生物信息學(xué)分析該蛋白經(jīng)翻譯后加工產(chǎn)生具有半胱氨酸蛋白酶活性的分子成熟蛋白分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖 信號(hào)肽及前肽序列切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)活性位點(diǎn)分析底物結(jié)合凹槽組織蛋白酶B（CTS

10、B） SSCP多態(tài)分析電泳圖 FF EF DF DE EE DD性狀TraitsDD(7)DE(12)DF(4)EE(8)EF(78)FF(38)最大剪切力(kg)Shear force6.360.68 AB6.310.53 AB4.990.84 AB4.910.62 A5.560.33 A6.560.35 B硬度值(kg.s)Toughness22.182.90 AB21.912.25 AB20.503.56 AB19.832.62 A20.711.41 A23.551.48 B平均剪切力(kg)Mean Shear force4.140.69 ab3.920.54 ab3.850.85 a

11、b2.880.62 ab3.330.34 a4.850.35 b檢測(cè)了位于CTSB基因第六內(nèi)含子內(nèi)的SSCP多態(tài)位點(diǎn) 檢測(cè)到了3種等位基因，6種基因型。FF基因型的個(gè)體表現(xiàn)出最高的最大剪切力、硬度值和平均剪切力，均極顯著（P0.01）或顯著（P0.05）地高于EE和EF基因型的個(gè)體。半胱氨酸蛋白酶抑制素B （CSTB） 半胱氨酸蛋白酶抑制素B（Cystatin B，CSTB），被認(rèn)為是最重要的胞內(nèi)組織蛋白酶抑制劑之一。 采用RT-PCR結(jié)合克隆測(cè)序的方法，克隆出了豬CSTB基因的mRNA序列。全長(zhǎng)541 bp，包括完整的CDS區(qū)和3端非編碼序列 。Markercds284 bpMarker3

12、RACE561 bp3 RACE 產(chǎn)物電泳圖Cds區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖mRNA序列紅框表示起始密碼子和終止密碼子 豎線表示預(yù)測(cè)外顯子分界點(diǎn) 克隆測(cè)序Cds區(qū)長(zhǎng)度299bp，編碼一個(gè)98殘基的肽段。生物信息學(xué)分析該蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑活性。半胱氨酸蛋白酶抑制素B （CSTB） 蛋白分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖 活性位點(diǎn)分析半胱氨酸蛋白酶抑制素B （CSTB） RFLP多態(tài)分析電泳圖 AA BB AB M性狀TraitsAAABBB樣本數(shù)Sample size102450最大剪切力(kg)Shear force5.11A1.617.13B2.216.76B1.69硬度值(kg.s)Toughness19.3

13、1A6.2126.42B9.1724.95B7.37平均剪切力(kg)Mean Shear force3.26A1.145.21B2.294.70B1.86檢測(cè)了位于CSTB基因第二內(nèi)含子內(nèi)的RFLP多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)到了2種等位基因，3種基因型。AA基因型的個(gè)體，在各項(xiàng)嫩度指標(biāo)上均極顯著的低于其它兩種基因型的個(gè)體（P0.01）。胰島素生長(zhǎng)因子（IGFs）是生長(zhǎng)激素(GH)誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有促生長(zhǎng)作用的肽類物質(zhì)IGFs的合成與分泌生長(zhǎng)激素水平的控制，通過(guò)反饋調(diào)節(jié)與生長(zhǎng)激素形成了一個(gè)激素調(diào)節(jié)軸體系（GH-IGF軸）。體內(nèi)大多數(shù)組織的生長(zhǎng)和代謝均受GH-IGF軸的調(diào)控。胰島素生長(zhǎng)因子-1（IGF-

14、1） GH/IGF-I 對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的激素調(diào)控軸 胰島素生長(zhǎng)因子-1（IGF-1） 性狀I(lǐng)GF-1第3外顯子 G-201-AAAABBBIMF4.066ab0.2263.528a0.2004.558b0.469大理石紋評(píng)分3.074ab0.0933.089 b0.0823.570c0.192失水率18.189a1.81916.721ab0.93812.008c1.670肌纖維面積3238.563206.753238.797205.0372326.011868.946201A等位基因B等位基因檢測(cè)了位于IGF-1基因第3外顯子內(nèi)的SNP位點(diǎn)檢測(cè)到了2種等位基因，3種基因型。BB基因型肉質(zhì)更好。等位

15、基因B可提高IMF、大理石紋評(píng)分 （P0.05）。胰島素生長(zhǎng)因子-1（IGF-1） 性狀I(lǐng)GF-1第4外顯子EEEFFFIMF3.460AB0.1953.880B0.2887.230C0.913大理石紋評(píng)分3.1670.0833.0650.1233.6150.388失水率18.299A1.13213.948AB1.19711.907B3.522肌纖維面積4158.089a320.5023247.020b253.8513263.146ab487.017440455E等位基因F等位基因SSCP多態(tài)分析電泳圖檢測(cè)了位于IGF-1基因第4外顯子內(nèi)的SSCP多態(tài)位點(diǎn)。檢測(cè)到了2種等位基因，3種基因型。等

16、位基因F可改善IMF和、保水率（P0.01）。胰島素生長(zhǎng)因子-1（IGF-1） 性狀5端側(cè)翼區(qū) 微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)CCDDGGCDCGDGIMF3.85a0.304.00a0.225.35bc0.663.89a0.333.86c0.463.47a0.35失水率16.711.9017.391.2811.763.4514.222.3313.062.8415.371.75肌纖維面積3516.16ab442.443715.32a255.952590.46ab851.393321.78ab442.443025.31ab649.242760.77b299.50微衛(wèi)星多態(tài)分析電泳圖檢測(cè)了位于IGF-1基因5端側(cè)

17、翼區(qū)內(nèi)的微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)到了6種基因型。GG基因型個(gè)體表現(xiàn)出更好的肉質(zhì)，具有高IMF、低失水率、低肌纖維面積 （P0.05） 。肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白 (L-FABP)FABPs屬于脂結(jié)合蛋白超家族成員，是一類分子量較小而對(duì)脂肪酸有高親和力的蛋白質(zhì)，承擔(dān)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，脂類代謝具有重要的調(diào)控作用。采用RT-PCR結(jié)合克隆測(cè)序的方法，克隆出了豬L-FABP基因的mRNA序列。全長(zhǎng)518 bp，包括完整的CDS區(qū)和3端非編碼序列 。mRNA序列紅框表示起始密碼子和終止密碼子Marker5RACE5 RACE 產(chǎn)物電泳圖3 RACE 產(chǎn)物電泳圖Marker3RACE肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白 (L-FABP

18、)1745C等位基因T等位基因SSCP多態(tài)分析電泳圖檢測(cè)了位于L-FABP基因第2外顯子內(nèi)的SSCP多態(tài)位點(diǎn)。檢測(cè)到了2種等位基因，3種基因型。等位基因C可提高IMF（P0.05）。CC TT CT 性狀L-FABP 第2外顯子CC (48)CT (55)TT (52)IMF4.86a 0.224.16b 0.234.05b 0.27pH1 6.31 0.046.27 0.046.36 0.05失水率2.07 0.162.05 0.171.99 0.20mRNA序列紅框表示起始密碼子和終止密碼子小腸型脂肪酸結(jié)合蛋白 (I-FABP)Marker5RACE3RACE擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖I-FABP是FABPs家族的另一個(gè)重要成員。同樣采用RT-PCR結(jié)合克隆測(cè)序的方法，克隆出了豬I-FABP基因的mRNA序列。全長(zhǎng)614 bp，包括完整的CDS區(qū)和3端非編碼序列 ?？寺y(cè)序小腸型脂肪酸結(jié)合蛋白 (I-FABP)性狀I(lǐng)-FABP 外顯子1內(nèi)A62G位點(diǎn)AA (58)AG (27)GG (40)IMF4.23a0.163.54b0.203.40b0.30大理石紋評(píng)分3.51A0.103.32AB0.183.13B0.12pH16.41a0.046.44a0.056.21b0.09pH26.090.05 6.050.066.020.08失水率12.480