多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片斷

1、關(guān)于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片斷第一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過(guò)程美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng) 第二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一.基礎(chǔ)知識(shí)脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥(niǎo)嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一個(gè)核苷酸上的磷酸基團(tuán)上的“OH”和另一個(gè)核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸

2、二酯鍵，即在相鄰的兩個(gè)脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過(guò)3、5、磷酸二酯鍵彼此連接起來(lái)形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端3.多脫氧核苷酸鏈得形成多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖第四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu).DNA分子是由 的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則 結(jié)構(gòu)。. 與 交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在鏈的內(nèi)側(cè)。.兩條鏈上的堿基通過(guò) 連結(jié)起來(lái)，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與 配對(duì)， 一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反

3、向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥(niǎo)嘌呤第五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.DNA的復(fù)制2.時(shí)期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場(chǎng)所細(xì)胞核（主要）、線粒體、葉綠體。1.概念由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過(guò)程。4.基本條件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.邊解旋邊復(fù)制(過(guò)程）5.復(fù)制特點(diǎn).半保留復(fù)制（結(jié)果）6.遵循原則：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則7.精確復(fù)制的原因8.復(fù)制的意義DNA分子通過(guò)復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板堿基

4、互補(bǔ)配對(duì)能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無(wú)誤的進(jìn)行第七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月總結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3端開(kāi)始連接脫氧核苷酸第八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(二）PCR原理及條件1概念：PCR即_，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA2DNA的平面結(jié)構(gòu)：AGCT5端3端氫鍵ATGC3端: -OH端5端:磷酸基團(tuán)的末端注意：1、DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈，因此，DNA

5、復(fù)制需要引物 2、DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸第九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）、 DNA 分子的熱變性原理DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物與兩條單鏈結(jié)合 在80100 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為變性。3、PCR原理第十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在80100C的溫度范圍內(nèi)， DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為變性.當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈. 高溫雖然打開(kāi)了雙鏈，可會(huì)導(dǎo)致酶失活。怎么辦？ 第十一張，PP

6、T共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化.3、 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用第十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）、PCR 反應(yīng)的條件DNA模板；分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（引物和引物）；四種脫氧核苷酸；耐高溫的聚合酶（Taq DNA聚合酶）；控制溫度，但不需解旋酶；需要在一定的緩沖液中進(jìn)行。第十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)13步30輪（2）、步驟：變性 復(fù)性延伸第十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于20

7、22年6月解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（ RNA）打開(kāi)DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3端開(kāi)始連接脫氧核苷酸 思考：3、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件是什么？ 體外擴(kuò)增DNA 如何提供相似環(huán)境？ 變性（ 80-100 ）Taq聚合酶（耐高溫）2030個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNA第十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制與PCR的比較第十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA聚合酶與DNA連接酶的異同第十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、

8、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等特點(diǎn)。 6 、 PCR技術(shù)的特點(diǎn)第十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（五） PCR的反應(yīng)過(guò)程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟變性、復(fù)性和延伸變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2、循環(huán)過(guò)程第十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性第二十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月復(fù)性（退火） 模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到

9、500C左右， 引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合第二十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火第二十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月延伸DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈第二十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸第二十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月靶序列 靶序列第1個(gè) PCR 循環(huán)完

10、成后 ：得到兩個(gè)拷貝的靶序列第二十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、循環(huán)特點(diǎn)：上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板 結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無(wú)引物存在于兩個(gè)子代DNA分子中 其它子代DNA分子都為雙引物分子式 處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)12N第二十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、PCR 循環(huán)的結(jié)果 DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸第二十

11、八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量第二十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)條件： 穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境 DNA模板 分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物 A、T、G、C四種脫氧核苷酸 耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶 能嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備第三十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、PCR儀.設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。二.PCR的實(shí)驗(yàn)操作第三十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍

12、頭用一次更換一次。第三十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月微量離心管微量移液器第三十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、準(zhǔn)備2、移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟 按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑第三十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月過(guò)程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢第三十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循

13、環(huán)程序過(guò)程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部， 提高反應(yīng)效果第三十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR三步曲 預(yù)變性保溫 變 性94 30s延伸 721min復(fù)性 5530s94 5min第三十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：6、注意事項(xiàng)隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭第三十九張，PPT共五十

14、二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三、課題成果評(píng)價(jià)1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a x2 n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1 、原理可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第四十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月稀釋2LPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零測(cè)定取DNA稀釋液100L至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值計(jì)算DNA含量（ g

15、/ml ）50 (260nm的讀數(shù)）稀釋倍數(shù)2.過(guò)程第四十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月比色杯第四十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 PCR的突出優(yōu)點(diǎn)快速高效靈活易于操作四、 課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）第四十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、實(shí)驗(yàn)小結(jié) PCR儀加熱使（ ）變性, 復(fù)性使引物與模板DNA（ ）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( ),在（ ）的作用下,以 （ ）為原料,以（ ）為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（ ）三個(gè)階段為

16、一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過(guò)30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見(jiàn)到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補(bǔ)Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72第四十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.提示：繪圖可參考教科書(shū)中圖5-9。PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段（2n=230=1 073 741 824)。2.提示：PCR引物是根據(jù)需要擴(kuò)增的目標(biāo)DNA的堿基序列來(lái)設(shè)計(jì)的。引物的設(shè)計(jì)需要豐富的分子生

17、物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，感興趣的學(xué)生可以參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（見(jiàn)本專題參考書(shū)目），書(shū)中有詳盡的論述。書(shū)后題第四十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三.課題成果評(píng)價(jià)1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a2n.實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1.原理可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過(guò)程.稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋.第四十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值.計(jì)算.計(jì)算DNA含量(g)50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)50：1 g /ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02第四十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月光吸收波長(zhǎng)nm2602402202800.10.2第四十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月比色杯第五十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五.實(shí)驗(yàn)小結(jié)P