動物基因工程

1、關(guān)于動物基因工程第一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 基因工程概述 基因工程(Genetic engineering)是一種DNA重組技術(shù)，它是在分子水平上進行的遺傳操作，即把供體細胞中的基因或基因組提取出來，按照預(yù)先設(shè)計的藍圖，經(jīng)過體外加工重組，或者把人工合成的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞并獲得新的遺傳特性的技術(shù)。由于被轉(zhuǎn)移的基因必須與載體DNA重組后才能實現(xiàn)轉(zhuǎn)移，所以基因工程也叫做重組DNA技術(shù)。基因工程的基本操作程序包括：(1) 目的基因的分離或合成；(2)用工具酶對目的基因和載體（Vector）進行加工處理，把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子；(3)把重組DNA分子引入受體細胞

2、，并使目的基因和載體上其他基因得以表達；（4）轉(zhuǎn)化體細胞的擴增；（5）重組體細胞的鑒定與篩選。第二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因克隆示意圖第三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標記、補平3末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶第四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內(nèi)切酶細菌限制修飾體系 限制性核酸內(nèi)切酶 甲基化酶識別特異的位點酶切位點回文結(jié)構(gòu) 46 bp出現(xiàn)兩種末端粘性末端 粘端 平頭末端

3、 平端 配伍末端第五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、DNA聚合酶 （一）DNA聚合酶I (全酶) (E. coli DNA Polymease)（二）K1enow片段(E.co1i) （三）T4 DNA聚合酶 (T4噬茵體感染的Eco1i) （四）Taq DNA聚合酶(Thermusaqraticus) （五）逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） （六）末端轉(zhuǎn)移酶 第六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、DNA連接酶 在大腸桿菌和動物細胞中都發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，這種酶能夠催化DNA中相鄰的 3一OH和5一磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵。連接反應(yīng)的最適溫度

4、是37，但在此溫度下粘性末端之間氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定。實驗表明，15對于連接反應(yīng)和粘性末端氫鍵結(jié)合的穩(wěn)定性都是合適的。四、甲基化酶 細胞的限制一修飾系統(tǒng)中的修飾作用是由甲基化酶(methylase)米完成的。甲基化酶同限制性內(nèi)切酶具有完全相同的識別順序。甲基化酶使識別順序中的某個堿基發(fā)生甲基化，保護DNA不被限制性內(nèi)切酶切開。真核生物中目前只發(fā)現(xiàn)5甲基胞嘧啶(M5C)。 第七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 五、核酸酶 （一）核酸酶S1 (Nuclease S1) 核酸酶S1主要用于：(1)分析DNA：RNA雜交體結(jié)構(gòu)。通過降解成熟mRNA與放射性標記基因組、DNA的雜交體確定內(nèi)含子部位

5、。 (2)切除DNA片段上的單鏈末端，形成平末端。(3)切開cDNA合成過程中形成的發(fā)夾環(huán)。 (4)在限制酶位點上產(chǎn)生小缺失。 (二)核酸外切酶III （三）核酸外切酶VII（四）DNA酶I （五）RNA酶A (牛胰) （六）RNA酶TI （七）RNA酶H 第八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié)基因工程的載體（Vector） 到目前為止，用于基因工程的載體有8類： 細菌質(zhì)粒載體；包括大腸桿菌和枯草桿菌質(zhì)粒載體。 噬菌體衍生載體。 柯斯質(zhì)粒(Cosmid)載體：一種由質(zhì)粒和A噬菌體cos尾巴構(gòu)建 的復(fù)合載體。 噬菌體M13衍生載體一類專門用于Sanger法測序的載體。 Phag9m

6、5d載體：一類由噬菌體功能片段和質(zhì)粒構(gòu)建的復(fù)合 載體。 酵母質(zhì)粒載體：由酵母2u質(zhì)粒構(gòu)建的酵母基因工程載體。 真核病毒載體：包括動物病毒、植物病毒衍生載體。 桿狀病毒和Bacmid載體； 第九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月作為基因工程的載體它們都具備以下一些共同的基本特點：作為基因工程的載體它們都具備以下一些共同的基本特點： 在宿主細胞中能獨立自主地復(fù)制。 表達載體含有強啟動于，能驅(qū)動靶基因在宿 主細胞中表達。 容易從宿主細胞中分離純化。 載體DNA基因組中有一段不影響它們復(fù)制的非必需區(qū)域，插在其中的靶片段能被動地跟著載體DNA一起復(fù)制，就像載體的正常成分一樣。第十張，PPT共三十

7、八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒載體(plasmid vector) （1）質(zhì)粒的一般性質(zhì) 1質(zhì)粒的概念 質(zhì)粒是細菌細胞染色體外存在于細胞質(zhì)中能進行自我復(fù)制的一類小型DNA分子，大部分質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀。 2質(zhì)粒的大小 3質(zhì)粒的拷貝數(shù) 4質(zhì)粒的不親和性 5質(zhì)粒的宿主范圍 第十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子理想的質(zhì)粒 1.拷貝數(shù)多; 2.兩三個抗藥性基因 terr ampr 篩選標志3.合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點（單一）第十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）噬菌體載體( Ph

8、age vector) 噬菌體是一種溫和噬菌體，由于它的遺傳結(jié)構(gòu)和宿主大腸桿菌的遺傳結(jié)構(gòu)研究得比較清楚，并能在細菌中大量繁殖，所以成為廣泛采用的載體。噬菌體還有一大優(yōu)點，即使它的DNA丟失25仍不失活，這部分丟失的空檔正好可以裝載外源DNA。與質(zhì)粒載體相比，噬菌體作為載體可以克隆更大一些的DNA片段，欲構(gòu)件一個基因文庫，往往可以減少文庫中克隆的數(shù)量。第十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）柯斯質(zhì)粒載體（Cosmid vector） 柯斯質(zhì)粒載體又叫粘粒載體，這是一種由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體?？滤官|(zhì)粒在結(jié)構(gòu)組成上具有噬菌體的特性、也具有質(zhì)粒

9、載體的特性和高容量的克隆能力，一般可插入3540kb的外源基因，這是構(gòu)建真核生物基因文庫的主要載體。柯斯質(zhì)粒適用于作基因簇和大基因的克隆。 第十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）YAC載體 YAC是酵母人工染色體（Yeast artificial chromosome）的縮寫，是目前能容納最大外源DNA片段的載體。簡單地說，酵母人工染色體載體有兩個臂，之間有著絲粒，每個臂的末端有一個端粒，另外，染色體上還有供選擇的標記基因；當外源DNA片段連接進兩個臂中以后，通過選擇標記人們可以從酵母宿主細胞中篩選出重組的人工染色體。 實驗結(jié)果證明，每個YAC都可以裝進100萬堿基以上的DNA

10、片段，這種大小比柯斯質(zhì)粒的裝載能力要大數(shù)倍，所以可以保證基因結(jié)構(gòu)的完整性。第十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(五) 動物病毒 動物病毒作為載體可用于外源基因向真核細胞的轉(zhuǎn)入。作為基因介導(dǎo)的動物DNA載體，必須具備以下條件：(1)具有動物病毒的復(fù)制起始部位及啟動子，以便外源基因能有效的轉(zhuǎn)染動物細胞，以及提供必要的轉(zhuǎn)錄信號：(2)具有可供選擇的標志基因，因為重建的病毒轉(zhuǎn)染力很低，一般僅為105107，只有利用標志基因才能選出轉(zhuǎn)化細胞株；(3)具有適當?shù)亩喾N單一內(nèi)切酶位點供外源基因插入。 目前常用的基因轉(zhuǎn)移載體有：(1)猴空泡病毒(Simian virus 40簡稱SV40)；(2)腺

11、病毒(Adenovirus)；(3)乳頭狀病毒(Papilloma virus)；(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus); (5) 牛痘(Vaccinia)病毒; (6) 牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。第十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、獲得目的基因的方法 (一)利用理化方法分離基因 理化方法分離基因是依據(jù)DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的特點和四種堿基互補的氫鍵差異，其方法有以下四種： 1密度梯度超速離心法 2單鏈酶法 3多聚賴氨酸法 4分子雜交法第十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)利用生物學(xué)方法分離基因 利用噬菌體轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化等微生物學(xué)技

12、術(shù)分離基因的方法，我們把它叫做生物學(xué)方法。這種方法應(yīng)用于原核基因的分離提取。 用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(Restriction endonuclease )將整個染色體或DNA分子切成許多相當于一個或略大于一個基因的片段，然后把全部DNA片段與質(zhì)粒組成重組DNA分子，并轉(zhuǎn)化到某特定基因營養(yǎng)缺陷型受體菌內(nèi)，進行純系繁殖，再經(jīng)分離鑒定，選出所需基因。第十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (三)基因的人工合成 化學(xué)合成法逆轉(zhuǎn)錄法(Reverse transcription) 逆轉(zhuǎn)錄法也叫cDNA法，它是一種酶促合成法，即以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以四種脫氧核苷三磷酸為材料合成DN

13、A(cDNA)，再經(jīng)復(fù)制后即成雙鏈DNA。3. 聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)第二十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、重組DNA分子 1. 粘性末端連接 連接效率高相同酶切末端配伍末端2.平端連接 連接效率低3.同聚物接尾法4.人工接頭法第二十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月五、基因的轉(zhuǎn)移(Gene transfer)(一)、重組DNA向細菌細胞轉(zhuǎn)入 把以質(zhì)粒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程叫做轉(zhuǎn)化(Transformation)；把以噬菌體或病毒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程叫做轉(zhuǎn)染(Transfetio

14、n)。對細菌細胞進行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是細胞處在感受態(tài)，所謂感受態(tài)細胞，就是受體細胞處于攝入外源DNA的狀態(tài)。一般用0.010.05 M/L氯化鈣處理受體細胞，可以引起細胞膨脹，增大細胞的通透性，使重組DNA進入細胞，提高轉(zhuǎn)化效率。第二十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 transduction病毒、噬菌體介導(dǎo)溶菌途徑溶原菌途徑第二十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(二)、外源目的基因向真核細胞轉(zhuǎn)入 向真核細胞中轉(zhuǎn)移基因的方法可分為兩大類，類需借助于載體，另類不需借助于載體。 1 借助于載體的基因轉(zhuǎn)移 2不需載體的基因轉(zhuǎn)移 磷酸鈣沉淀法 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 血影細胞(B

15、lood shadow cell)介導(dǎo)法 第二十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月六、轉(zhuǎn)化細胞的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的效率是很低的(一般為105106)，也就是說，只有極少數(shù)細胞接受到重組DNA分子，能實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。所以必須從大量的培養(yǎng)細胞中篩選出已被外源DNA轉(zhuǎn)化了的細胞，然后建立無性繁殖系，使所需基因大量擴增和表達。 第二十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月重組體的篩選 screening/selection 1. 直接選擇法 抗藥性標志選擇 標志補救 表達產(chǎn)物與營養(yǎng)缺陷互補 互補 藍白斑篩選 分子雜交 探針原位雜交 /Southern印跡法 限制性酶切圖譜/PCR

16、 2.非直接選擇法 免疫學(xué)方法第二十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月七 克隆基因的表達 載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件 密碼子通用1 、 原核表達體系 原核表達載體的標準合適的篩選標志強啟動子翻譯控制序列多克隆位點第二十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月融合蛋白 包涵體大腸桿菌表達體系的不足缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，只能表達cDNA缺乏翻譯后加工機制，不能折疊和糖基化融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性很難表達大量的可容性蛋白第二十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月真核表達體系 篩選標志 Neor G418轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣沉淀DEA

17、E葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射瞬時轉(zhuǎn)染 目的基因不整合進宿主基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 目的基因整合進宿主基因組 第三十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù) 一、轉(zhuǎn)基因動物的概念 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA導(dǎo)入細胞的一種技術(shù)。它是在DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。1981年Gordon和Ruddle首次用顯微注射法(Microinjection)把外源基因?qū)胄∈笫芫训男酆耍⒆⑸浜蟮氖芫阎踩爰僭心甘笞訉m，產(chǎn)生了的78只小鼠，其中有2只的所有細胞中(包括生殖細胞)都含有外源基因，但因缺乏啟動子而不能表達，他們把出生后帶外源基因的小鼠叫做轉(zhuǎn)基因小鼠(Transg

18、enic Mice)，自此以后，凡帶有外源基因的動物都叫做轉(zhuǎn)基因動物(Transgenic animal)。第三十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的一般步驟 (1)選擇能有效表達的蛋白質(zhì)；(2)克隆與分離編碼這些蛋白質(zhì)的基因；(3)選擇能與所需組織特異性表達方式相適應(yīng)的基因調(diào)節(jié)序列；(4)把調(diào)節(jié)序列與結(jié)構(gòu)基因重組拼接，并在培養(yǎng)細胞或小鼠中預(yù)先檢驗其表達情況；(5)把拼接的基因注射到受精卵的細胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宮，完成胚胎發(fā)(7) 檢測幼畜是否整合外源基因、外源基因的表達情況以及外源基因在其后代中的傳遞情況。 第三十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、導(dǎo)入基因的方法 導(dǎo)入外源基因的方法有多種，一些方法已在上一節(jié)作過敘述，如：反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法；磷酸鈣沉淀法；脂質(zhì)體介導(dǎo)法；血影細胞(Blood shadow cell)介導(dǎo)法。在此再介紹一些方法，1）DNA微注射法；2）精子載體法；3)胚胎干細胞（ES）介導(dǎo)法；4) 染色體片段注入法；5) 電轉(zhuǎn)移法等。在轉(zhuǎn)基因動物中，DNA微注射法比較常用。 第三十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、基因的選擇與轉(zhuǎn)基因動物的研究現(xiàn)狀 (一) 轉(zhuǎn)入基因的選擇 (二) 轉(zhuǎn)基因動物的研究意義1提高動物生長、生產(chǎn)性能的研究 2改變奶蛋白