同濟醫(yī)院檢驗科ISO15189體系文件18.血紅蛋白A2定量測定

1、同濟大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科血液組項目操作指導書TJYYJYKMY/XMZ118第2版標題: 血紅蛋白A2定量測定第1章 第18節(jié)第 PAGE 5 頁 共 NUMPAGES 5 頁 目的；保證血紅蛋白A2定量測定結(jié)果準確、可靠。 適用范圍：血紅蛋白A2定量測定 項目名稱：血紅蛋白A2定量測定 檢測方法:：電泳法 原理：HbA2的等電點與HbA和HbF不同，在同一電場下，其泳速不同。將受檢者溶血液用醋酸纖維薄膜在PH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液中或不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中電泳，使HbA2與其他Hb分離，用比色法測定洗脫的HbA2及其他Hb的量，計算出HbA2所占百分比。 試劑:6.1 品牌；醋酸

2、纖維薄膜 浙江臺洲生化塑料廠氨基黑10B 上海試劑三廠甲醇 上海試劑三廠 冰乙酸 上海試劑三廠 巴比妥 上海試劑三廠 巴比妥鈉 上海試劑三廠 NaOH 上海試劑三廠氯仿 上?；瘜W試劑廠6.2 貨號：醋酸纖維薄膜 Q/HSG1-93氨基黑10B CI20470甲醇 13-20102820II 冰乙酸 13-2010279002II 巴比妥 22-588-67 巴比妥鈉 23-489-52 NaOH 13-20102230II氯仿 13-2010282017II6.3 包裝規(guī)格：醋酸纖維薄膜 8*12CM氨基黑10B 25g/瓶甲醇 500mL/瓶冰乙酸 500mL/瓶 巴比妥 500g/瓶 巴比

3、妥鈉 500g/瓶 NaOH 500mL/瓶 氯仿 500mL/瓶6.4 內(nèi)含物：PH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液洗滌液染色液：氨基黑10B染液浸出液：0.04N NaOH 儀器：電泳儀 操作步驟：8.1 被檢者血紅蛋白液的制備：8.1.1 標本：前綴為05真空條碼管采集的抗凝血3ml左右。8.1.2 離心10分鐘，2000轉(zhuǎn)/分。用滴管吸去上層血漿。8.1.3 沉淀的紅細胞，用至少8倍的生理鹽水洗滌三次，每次離心2000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，最后一次以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，盡量吸去上清液，記錄壓積紅細胞的量。8.1.4 在壓積紅細胞中加入等量蒸餾水，充分震蕩，使完全溶血，隨后加入紅

4、細胞一半體積的氯仿，用力掙搖5分鐘左右。8.1.5 3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用吸管將上層清晰的血紅蛋白液吸出，置于另一試管內(nèi)，保存在4冰箱內(nèi)使用。8.2 浸膜：8.2.1 在醋纖薄膜的無光澤面，在管頂?shù)碾姌犹巹澮粭l鉛筆線，此為點樣線，點樣線的位置根據(jù)所用緩沖液PH值不同而相異：用堿性電泳括PH8.6，點樣線瑩在距醋纖薄膜一端2cm 處，如用PH6.0-7.0及不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，點樣線應任薄膜的中央位置。8.2.2 將薄膜漂浮在緩沖液表面，待其均勻浸濕后,沉下浸泡至少20分鐘,如用不連續(xù)緩沖系統(tǒng),應浸于等量0.26mol/lTEB緩沖液和0.025mol/l巴比妥緩沖液的混合液中.8.3 點樣:

5、取出薄膜并用濾紙輕輕吸干,用血紅蛋白的吸管吸取受檢者血紅蛋白液5ul,均勻涂布在2.5cm寬的軟片一端的邊緣,然后將軟片垂直接觸醋酸纖薄膜的點樣處,使Hb液均勻沾在薄膜上或一條狹窄整齊的直線.8.4 電泳:將電泳緩沖液到入電泳箱中,并使兩邊液面平衡,將點樣后的醋纖薄膜光澤面向下放在電泳槽架上,并以四層紗布作橋. 通電: 電流強度 1MA 電壓 130-150V 時間 1-2小時一般至HbA離開點樣處約2.5-3cm時,可停止電泳.8.5 染色:將取出薄膜用氨基黑10B或麗春紅染色10分鐘,冬季時間略長.8.6 洗脫: 將染色后的醋纖薄膜,用洗脫液浸洗數(shù)次,直至背景漂凈為止.8.7 結(jié)果觀察:正常人血紅蛋白示意圖: (+) (-) HbA+HbF HbA2 碳酸酐酶 基質(zhì)蛋白 8.8 比色：以浸出液零在波長600nm處，比色，各色帶讀取出吸光度3次，取平均值。計算： HbA2OD值HbA2%= 100% HbA2OD值+HbA（包括HbF）OD值5 線性范圍：無10. 參考范圍：正常成人：HbA2%:1.53.1%新生兒：HbA2%1%(至1歲時才可達1%)11 臨床意義：HbA2大于3.5主要見于：地中海貧血鏈異常的不穩(wěn)定Hb病。12 病人準備標本要求：無溶血無脂血13 注意事項：13.1 在浸膜、點樣、電泳、染色、洗脫五步中的注意事項均同于血紅蛋白電泳。