槐耳浸膏對人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系轉(zhuǎn)移的抑制作用研究

1、槐耳浸膏對人肝癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系轉(zhuǎn)移的按捺作用研究李立新葉勝龍王艷紅孫瑞霞薛瓊陳潔高東梅湯釗猷【摘要】目的探究槐耳浸膏按捺肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為槐耳浸膏在臨床上治療肝腫瘤提供理論根據(jù)。要領(lǐng)將高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系H97H別離與槐耳浸膏1.0g/l，3.0g/l，5.0g/l，10.0g/l及DE含10%胎牛血清作用24h，測定其腫瘤細(xì)胞黏附率、活動按捺率及侵襲按捺率。效果各組H97H細(xì)胞經(jīng)槐耳浸膏作用24h后，其細(xì)胞黏附率顯著落落，而活動按捺率及侵襲按捺率顯著上升，與比擬組比擬差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且槐耳浸膏濃度與腫瘤細(xì)胞黏附率、活動按捺率及侵襲按捺率均有相干性。結(jié)論槐耳浸膏能顯著按捺肝癌細(xì)胞的黏附

2、、活動及侵襲本領(lǐng)，故可以阻抑肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?！娟P(guān)鍵詞】槐耳浸膏肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移按捺etastatiPtentialInhibitedithTraetesRbiniphilainHighlyetastatiPtentialHuanHepatellulararinaellsLinesAbstrat:PurpseTexplretheehanisfetastatiptentialinhibitedithTraetesrbiniphilainhuanhepatellulararinaellsandtprvidetheexperientalbasisfTraetesrbiniphilaintreatentf

3、rliveraner.ethdHighlyetastatiptentialhuanhepatellulararinaells(H97H)eretreatedithDEandTraetesrbiniphila(1g/l,3g/l,5g/land10g/l)fr24hrespetively.Theratesfellsadhesin,elltinandellsinvasinereeasured.ResultsAfterH97HellsinulatedithTraetesrbiniphilafr24h,theratesfellsadhesindereasedandellstinandellsinvas

4、ininreasedbviusly,ithsignifiantdifferenesbeteenTraetesrbiniphilagrupandntrlgrup.Theratesfellsadhesin,ellstinandellsinvasinererrelatedithnentratinfTraetesrbiniphila.nlusinTraetesrbiniphilaarkedlyinhibittheabilityfellsadhesin,tinandinvasininhighlyetastatiptentialhuanhepatellulararina,sitanarresttheeta

5、stasisfanerells.Keyrds:Traetesrbiniphila;hepatellulararinaells;etastasis；inhibitin槐耳是生長在中國古槐樹上的一種藥用真菌槐栓菌Traetesrbiniphilaurr，具有“治風(fēng)、“破血、“益力的成果，民間多用于治療癌癥和炎癥。由槐耳菌質(zhì)經(jīng)熱水提獲得到的槐耳浸膏含有多種有機(jī)身分和十余種礦物元素，其重要抗癌活性身分為卵白多糖PS?T。動物實行已證明槐耳浸膏具有顯著按捺腫瘤生長和延伸荷瘤動物保存期的成果，其制品槐耳顆粒已普及應(yīng)用于臨床,并有大量報道證明其對肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等腫瘤有奇特療效1。但其抗癌機(jī)制迄今尚

6、未見全面報道，尤其是在抗肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的底子研究方面所見報道少少。本研究目的即試圖通過槐耳浸膏干預(yù)肝癌細(xì)胞的黏附、活動、侵襲等方面，較為體系地探究槐耳浸膏按捺肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床治療肝癌提供部門理論根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1質(zhì)料H97H肝癌細(xì)胞系由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所創(chuàng)立。接納DE造就基含10%胎牛血清造就，每3d調(diào)換造就基。0.25%胰酶?EDTA消化液消化后1：3傳代。纖連卵白fibrnetin，F(xiàn)n和多聚賴氨酸購自Siga公司；小牛血明凈卵白BSA購自Rhe公司；HEPES購自erk公司。DEDulbedifiedEagleediu購自Gib/Brl公司；胎牛血清FBS購自Hylne公

7、司；胰卵白酶購自Dif公司。FALN細(xì)胞造就板，造就瓶購自BetnDikinsn公司。starTransell造就板3422，孔徑8.0，直徑6.5購自rning公司。姬姆薩染液的構(gòu)成為姬姆薩色素0.5g加甘油30l研磨，加甲醇500l，搖勻溶解。atrigelBaseentebraneatrix356237，PhenlRed?free購自BD公司。槐耳浸膏由江蘇蓋天力藥業(yè)提供。將槐耳浸膏溶于DE含10%FBS中，使其溶度別離為1.0g/l、3.0g/l、5.0g/l和10.0g/l。0.22濾器抽濾待用。緩沖液A的構(gòu)成為tris?Hl20l/L，pH7.4，氯化鈉150l/L，氯化鎂1l/L

8、，氯化鈣1l/L，氯化錳1l/L。緩沖液B的構(gòu)成為tris?Hl50l/L，pH7.4，氯化鈉100l/L，氯化鎂1l/L，氯化鈣2l/L，氯化錳1l/L。黏附緩沖液B的構(gòu)成為Hepes10l/LpH7.4，氯化鈉140l/L，氯化鉀5.4l/L，葡萄糖5.56l/L，3%BSA，氯化鎂1l/L，氯化鈣2l/L，氯化錳1l/L。1.2要領(lǐng)將Fn溶于緩沖液A10g/L，每孔參加0.1l。以100g/l多聚賴氨酸和1%BSA包被孔作為最大和最小黏附參照，4孵育留宿或天然枯燥，用緩沖液B洗板，黏附緩沖液B封阻30，2h，再用緩沖液B加1g/LBSA洗2次。已貼壁H97H細(xì)胞與槐耳浸膏1.0g/l，3

9、.0g/l，5.0g/l，10.0g/l及DE含10%胎牛血清作用24h，胰酶消化，1000r/in離心2in，棄上清，PBS洗3次。0.1%BSA溶液懸浮H97H細(xì)胞并調(diào)解為1106/l。每孔參加0.1l細(xì)胞懸液，37，5%2孵育3h。棄造就液，用黏附緩沖液B洗2次以去除未黏附之細(xì)胞。用3%多聚甲醛的PBS結(jié)實。用0.1l/L硼酸緩沖液pH8.5淋洗1次。參加含1%亞甲藍(lán)的0.1l/L硼酸緩沖液0.1lpH8.5，室溫安排20in。棄亞甲藍(lán)，用硼酸緩沖液洗4次。每孔參加1l/LHl0.1l，37，40in。在酶標(biāo)定量儀上用570n波長測定光密度值D570，盤算細(xì)胞黏附率。細(xì)胞黏附率=100%

10、用無血清DE造就液稀釋Fn7.5g/l，按每孔50l勻稱涂布于Transell小室濾膜上外貌。紫外線照耀4孵育留宿，利用前浸于無血清DE造就液中，37孵育2h待用。10%FBS?DE造就基通例造就細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿造就瓶底后，用無血清DE沖洗2次，加0.1%BSA?DE造就48h。離心去除細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)造就上清為腫瘤細(xì)胞趨化因子。過濾除菌，-20保存待用。已貼壁H97H細(xì)胞與槐耳浸膏1.0g/l，3.0g/l，5.0g/l，10.0g/l及DE含10%胎牛血清作用24h，胰酶消化，1000r/in離心2in，棄上清，PBS洗3次。0.1%BSA溶液懸浮H97H細(xì)胞并調(diào)解為1106/l。Transell

11、上室參加細(xì)胞懸液100l含1105個細(xì)胞，下室參加腫瘤細(xì)胞趨化因子600l，37，5%2孵育24h。孵育竣事后稍稍水洗，用棉簽擦去濾膜上外貌未穿膜的腫瘤細(xì)胞。濾膜甲醇結(jié)實30in，姬姆薩染色，將膜固封于載玻片上。200倍顯微鏡下計數(shù)5個差異視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均勻數(shù)，盤算活動按捺率。活動按捺率=100%用無血清DE造就液稀釋atrigel基質(zhì)2g/l，按每孔50l勻稱涂布于Transell小室濾膜上外貌。余實行步調(diào)同以上趨化活動試驗。在200倍顯微鏡下計數(shù)5個差異視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均勻值，盤算侵襲按捺率。侵襲按捺率=100%1.3統(tǒng)計闡發(fā)接納SPSS11統(tǒng)計軟件包，應(yīng)用單因素方差Bnferr

12、ni法闡發(fā)整理數(shù)據(jù)。應(yīng)用成對查驗相干性闡發(fā)ne?tail及成對查驗相干性闡發(fā)t?tail查驗槐耳浸膏濃度別離與腫瘤細(xì)胞黏附率、活動按捺率、侵襲按捺率之間的相干性。2效果2.1槐耳浸膏對細(xì)胞黏附本領(lǐng)影響H97H細(xì)胞與纖連卵白之間黏附力強(qiáng)，空缺比擬組細(xì)胞黏附率為75.561.343%。顛末槐耳浸膏作用24h后，細(xì)胞黏附本領(lǐng)顯著落落圖1。各槐耳浸膏組細(xì)胞黏附率別離為：1g/l組66.44%1.381%,3g/l49.23%2.067%,5g/l組36.66%1.892%,10g/l組30.12%1.741%。各組與比擬組比擬差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。應(yīng)用成對查驗相干性闡發(fā)ne?tail及成對

13、查驗相干性闡發(fā)t?tail查驗槐耳浸膏濃度與腫瘤細(xì)胞黏附率成負(fù)相干，相干系數(shù)別離為-0.9P0.01和-0.914P0.01。2.2槐耳浸膏對細(xì)胞趨動的影響H97H細(xì)胞活動本領(lǐng)較強(qiáng)，比擬組穿膜細(xì)胞數(shù)為49.643.189/200倍視野。顛末槐耳浸膏作用24h后，活動本領(lǐng)顯著落落，表現(xiàn)出較顯著的活動按捺力(圖2)。各槐耳浸膏組細(xì)胞活動按捺率別離為：1g/l組28.78%4.986%，3g/l組60.41%2.469%，5g/l組75.36%2.863%，10g/l組83.49%2.672%。各組與比擬組比擬差異均有統(tǒng)計學(xué)意義P0.01。應(yīng)用成對查驗相干性闡發(fā)ne?tail及成對查驗相干性闡發(fā)t?

14、tail查驗槐耳浸膏濃度與腫瘤細(xì)胞趨化活動按捺率成正相干，相干系數(shù)別離為0.863P0.01和0.977P0.01。2.3槐耳浸膏對細(xì)胞侵襲活動的影響H97H細(xì)胞侵襲力強(qiáng)，比擬組穿膜細(xì)胞數(shù)36.683.695/200倍視野。顛末槐耳浸膏作用24h后，侵襲力落落，表現(xiàn)出較顯著的侵襲按捺作用圖3。各槐耳浸膏組細(xì)胞侵襲按捺率別離為：1g/l組43.70%5.497%，3g/l組60.33%8.290%，5g/l組83.25%3.500%，10g/l組86.03%4.040%。各組與比擬組比擬差異均有統(tǒng)計學(xué)意義P0.01。應(yīng)用成對查驗相干性闡發(fā)ne?tail及成對查驗相干性闡發(fā)t?tail查驗槐耳浸膏

15、濃度與H97H細(xì)胞侵襲按捺率成正相干，相干系數(shù)別離為0.814P0.01和0.942P0.01。3討論惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移歷程包羅腫瘤細(xì)胞黏附adhensin，細(xì)胞外基質(zhì)extriellularatrix，E落解，細(xì)胞移行igratin三種根本征象13。腫瘤細(xì)胞之間及其與正常構(gòu)造、細(xì)胞之間的黏附狀態(tài)非常是腫瘤細(xì)胞侵襲的始動環(huán)節(jié)，它涉及多個黏附及去黏附歷程。黏附歷程包羅：腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮下基底膜及轉(zhuǎn)移灶宿主細(xì)胞的黏附。去黏附歷程包羅腫瘤細(xì)胞之間的去黏附及其脫離基底膜和內(nèi)皮細(xì)胞。黏贊同去黏附歷程的不竭瓜代是其侵襲的關(guān)鍵4，5。別的惡性腫瘤細(xì)胞在侵襲歷程中必要不竭排泄種種卵白酶來落解細(xì)胞外基質(zhì)

16、和基底膜，此中基質(zhì)金屬卵白酶如P?2，P?9等在這一歷程中起著緊張作用。腫瘤細(xì)胞正是依賴這些卵白酶來不竭落解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，并通過自身的偽足活動，以及前述的黏贊同去黏附歷程來產(chǎn)生侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，要操縱腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，就必需按捺腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)或基底膜或宿主細(xì)胞的黏附及其對基質(zhì)或基底膜的落解以及自身的活動。Fn為基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的緊張身分。腫瘤細(xì)胞從母體脫落伍，侵襲基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，通過膜外貌受體可黏附于Fn上而產(chǎn)生活動和遷徙，使腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。H97H細(xì)胞是由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所創(chuàng)立的高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株6。它體外侵襲力強(qiáng)，接種裸鼠后肺轉(zhuǎn)移率為100%。本次實行接納了該細(xì)胞株來檢

17、測槐耳浸膏對腫瘤細(xì)胞黏附、活動、侵襲本領(lǐng)的影響。效果提示：經(jīng)槐耳浸膏作用的H97H細(xì)胞的粘附率顯著落落，兩者之間存在劑量效應(yīng)相干性。細(xì)胞黏附率隨槐耳浸膏濃度的增長而落落，至10g/l時細(xì)胞黏附率較比擬組落落60.14%。經(jīng)槐耳浸膏作用的H97H細(xì)胞的活動、侵襲本領(lǐng)顯著落落，且細(xì)胞活動按捺率、侵襲按捺率與槐耳浸膏濃度均呈正相干。從以上實行效果，我們可以看到槐耳浸膏對H97H細(xì)胞的黏附、活動、侵襲本領(lǐng)均有顯著的按捺作用，從而阻抑腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移為臨床上槐耳浸膏防治肝癌的轉(zhuǎn)移提供了理論根據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1莊毅.真菌抗癌藥物槐耳顆粒的研制J.中國腫瘤，1999，812：540-543.2Stetler?stevensn,LittaElEinerD.Extraellularatrix:rlefatrixetallprteinasesinturinvasinandetastasisJ.FASEB,1993，7：1434-1440.3AznavrianS,urphyA,Stetle?stevensn,etal.leularaspetsfturellinvasinandetastasisJ.aner,1993，71(4)：1368-1382