實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)書(shū)：小牛胸腺DNA熔解溫度的測(cè)量

1、PAGE PAGE 206實(shí)驗(yàn)六 小牛胸腺DNA熔解溫度的測(cè)量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解DNA的變性性質(zhì)，及其熔解溫度的意義和用途。2. 掌握測(cè)量熔解溫度的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)DNA暴露在變性環(huán)境（加熱，有機(jī)溶液等）中時(shí)，其紫外吸收曲線就會(huì)顯著改變。如下圖所示，從25加熱至80，光吸收變化很小，但是當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，紫外吸收急劇增加，然后趨向一個(gè)恒定的A260 值，這條曲線叫做DNA的熔解曲線，曲線中吸收增加的中點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的溫度，定義為熔解溫度（Tm）。大多數(shù)DNA的熔解溫度都在80 90之間，光吸收通常增加40%。DNA分子中GC堿基對(duì)的含量越高，其雙螺旋結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定，Tm也就越高；DNA樣品中的

2、雜質(zhì)越多，光吸收的增加也就越小。每種DNA分子都有其特有的 Tm，可以用于DNA的鑒定與特征分析。 DNA的熔解曲線 本實(shí)驗(yàn)將采用熱變性的方法測(cè)量小牛胸腺DNA的熔解溫度，有兩種方法可供選擇。 方法一：需要一臺(tái)帶有超級(jí)恒溫水浴和恒溫樣品池架的分光光度計(jì)，其溫度在25100之間可調(diào)，要使用高沸點(diǎn)溶劑（如乙二醇）作為循環(huán)液體。把裝有DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液的石英比色杯放入分光光度計(jì)的恒溫樣品池架中，按不同的溫度間隔升高溫度，平衡后，測(cè)量其260nm處的紫外吸收（A260）。要考慮到，在加熱過(guò)程中，水體積增加會(huì)使DNA濃度降低。 另一種方法是，取一支裝有DNA溶液的試管，測(cè)量其2 5時(shí)的A260。然后將幾管裝

3、有同樣DNA溶液的試管在不同溫度的恒溫水浴中加熱。15分鐘后迅速將試管放在冰浴中冷卻，然后迅速測(cè)量其A260。這種方法的主要缺點(diǎn)是變性DNA冷卻后引起DNA雙鏈的部分再結(jié)合，所以A260的增加一般只有1020%。三、器材與試劑 1. 紫外分光光度計(jì)2. 超級(jí)恒溫水浴 3. 普通恒溫水浴4. 石英比色杯（帶蓋）5. 冰浴桶6. 水浴鍋7. 試管8. 緩沖液：0.015mol/L檸檬酸鈉0.15mol/L氯化鈉溶液9. DNA溶液：用實(shí)驗(yàn)五所得小牛胸腺DNA和緩沖液，配制A260= 0.4左右的DNA 標(biāo)準(zhǔn)溶液。溶解此DNA需較長(zhǎng)時(shí)間的攪拌。四、操作步驟方法一：用超級(jí)恒溫水浴測(cè)量Tm打開(kāi)分光光度計(jì)

4、，予熱20分鐘，將超級(jí)恒溫水浴的溫度設(shè)為25，以測(cè)量起始的光吸收，將裝有檸檬酸鈉緩沖液的參照比色杯和裝有標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液的樣品比色杯放入分光光度計(jì)的樣品池架中的相應(yīng)位置。放置3分鐘，使比色杯內(nèi)外的溫度達(dá)到平衡，將此時(shí)的參照杯A260調(diào)為零，記下此時(shí)的DNA的樣品的A260，這個(gè)測(cè)量要十分小心，因?yàn)樗袦y(cè)量值都要與25的這個(gè)值進(jìn)行比較。然后，將溫度升至50，取出比色杯，輕叩杯壁以去除內(nèi)壁上的氣泡。將比色杯放回樣品池架，測(cè)量后繼續(xù)加熱至80，平衡5分鐘后，記下其A260，再升高2，平衡5 分鐘后記下其A260，重復(fù)此操作步驟至A260達(dá)到恒定值?？梢宰⒁獾皆谝粋€(gè)510的溫度范圍內(nèi)，A260有一個(gè)較大

5、幅度的增加。根據(jù)不同溫度下水的體積變化對(duì)不同溫度下的A260（即A260,T）進(jìn)行補(bǔ)償后，以A260,T / A260,25作縱軸，T作橫軸，畫(huà)出小牛胸腺DNA的熔解曲線，并求出Tm。方法二：用普通恒溫水浴的方法測(cè)量Tm。將恒溫水浴的溫度分別設(shè)為50、70、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98和100，往15支試管中各加入標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液3ml，蓋上橡皮塞或包上塑料薄膜。100水浴鍋中放兩支，其余12個(gè)恒溫浴中各放一支。剩下一支室溫放置，并測(cè)量其A260，即為基準(zhǔn)值A(chǔ)260,25。將100水浴鍋中的一支試管，連同水浴鍋一起在室溫下緩慢冷卻至室溫，放置1小時(shí)后再測(cè)其A260。

6、其余試管均溫浴15分鐘后，取出迅速放入冰水中，冷卻10分鐘以上，由冰水中取出就立即測(cè)量A260，即為各A260,T。 紫外分光光度計(jì)要提前打開(kāi)，調(diào)好零點(diǎn)，做好準(zhǔn)備。用溶解DNA的緩沖液作參比。測(cè)完后，以A260,T/ A260,25為縱軸，T為橫軸作圖（去除100加熱，室溫下緩慢冷卻的點(diǎn)），求出小牛胸腺DNA的Tm。（取曲線上直線部分延長(zhǎng)線的交點(diǎn)之間的中點(diǎn)求出Tm。）五、思考問(wèn)題1、DNA變性后，為什么會(huì)產(chǎn)生增色效應(yīng)？2、予測(cè)并解釋下列條件對(duì)天然DNA的Tm的影響。（1）pH=12的緩沖液（2）蒸餾水（3）50% 的甲醇（4）1% SDS0.15mol/L NaCll0.015mol/L檸檬酸鈉（pH7.0）3、根據(jù)%GC=2.