川芎嗪對小鼠小細胞肺癌血管生長和VEGF表達的抑制

1、川芎嗪對小鼠小細胞肺癌血管生長和VEGF表達的抑制【摘要】目的觀察川芎嗪對實體腫瘤及其血管生長的抑制作用及作用環(huán)節(jié)。方法用57bl小鼠接種小細胞肺癌細胞造模,川芎嗪注射液100、200g/kg/d腹腔注射,21d后檢測腫瘤體積、重量及微血管密度,并用esternblt法和免疫組化法分析腫瘤細胞vegf的表達。結果川芎嗪能減少小鼠小細胞肺癌腫瘤體積、重量,降低腫瘤微血管密度,抑制腫瘤細胞vegf的表達。結論川芎嗪能抑制小鼠小細胞肺癌的生長,其機制可能與抑制vegf表達、降低腫瘤微血管密度有關?！娟P鍵詞】川芎嗪小細胞肺癌微血管密度血管內(nèi)皮生長因子惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤組織中新血管生成,抑制

2、血管生成能抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移1。腫瘤細胞可以分泌多種血管生成因子,其中血管內(nèi)皮生長因子(vegf)是高效、高特異性作用于血管內(nèi)皮的促血管生成因子,與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移親密相關2。川芎是著名的活血、化瘀、抗腫瘤中藥。川芎嗪可以抑制腫瘤的生長,其機制與其促進免疫功能有關3。川芎素(阿魏酸鈉)抑制人肺癌a549細胞增殖,其機制與誘導細胞凋亡有關4。本試驗觀察川芎嗪對小鼠小細胞肺癌的抑制作用以及對腫瘤微血管密度和vegf表達的影響,旨在討論活血化瘀中藥可能存在的其它作用及其機制。1材料與方法1.1藥品與試劑鹽酸川芎嗪注射液tp，4g/2l/支，北京市第4制藥廠,硫酸魚精蛋白注射液(pt,50g/5l/

3、支,上海生物化學制藥廠),vegf抗體和因子抗體santaruze產(chǎn)品，sab試劑盒武漢博士德生物工程，其余試劑均為市售分析純。1.2動物分組與造模5取40只1820g的57bl小鼠(購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心),雌雄各半,隨機分為4組，川芎嗪1、2組、魚精蛋白組(陽性對照)、生理鹽水組(ns)。取接種小細胞肺癌細胞購自中國科學院細胞庫)14d的57bl荷瘤小鼠脫頸椎處死,無菌條件下取瘤組織加生理鹽水研磨成勻漿,調(diào)細胞濃度后,每只正常57bl小鼠右臀部皮下接種1107個小細胞肺癌細胞。1.3實驗方法川芎嗪組劑量分別為100、200g/kg,生理鹽水組每只0.2l,接種后第2天開場用藥,每天1

4、次,腹腔注射連續(xù)21d;魚精蛋白組60g/kg,接種后第2天皮下注射1次,第3天起每12小時1次,連續(xù)20d。第22天脫頸椎處死各組小鼠進展檢測。1.4一般檢測接種前和接種后每3天稱量1次體重,按體重變化調(diào)整給藥劑量。接種后每3天用游標卡尺測量1次荷瘤小鼠腫瘤的最長徑(a)和最小徑(b),按v=0.5ab2計算腫瘤體積,第22天處死小鼠,取接種部位腫瘤稱重,計算腫瘤生長抑制率腫瘤生長抑制率(%)=(生理鹽水組平均瘤重-治療組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重100%。1.5免疫組化染色取腫瘤組織,固定、脫水、包埋,4連續(xù)切片,vegf抗體或因子抗體為抗,陰性對照用pbs代替抗,按照試劑盒說明書進展

5、sab法免疫組織化學染色。1.6vegf表達的定量分析選取陽性細胞密集區(qū)域,在400顯微鏡下選取20個陽性細胞,用圖像分析系統(tǒng)測定平均吸光度(a值),以此代表陽性細胞胞質(zhì)單位面積內(nèi)vegf相對含量。1.7腫瘤微血管密度分級vd)根據(jù)eidner1標準對著染的血管進展密度分級。高血管密度區(qū)多位于腫瘤邊緣。在200倍鏡每0.742的視野下,以與周圍腫瘤細胞和結締組織成清楚顯區(qū)別的棕黃色內(nèi)皮細胞或細胞叢作為一個微血管,記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù),取其平均值。1.8esternblt參照文獻6,取腫瘤組織,溶于laelis溶解緩沖液中(1%tritnx-100,1l/lpsf,21g/lartinin,

6、0.5g/lleupeptin,1%sds)，離心后將上清液移于另一試管中。lry法檢測溶解液中蛋白含量。參加2sds加樣緩沖液(125l/ltris-hl，20%甘油,0.01%溴酚藍,4%sds,200l/ldtt)，置沸水浴中加熱5in,按每孔30g蛋白量加樣進展sds2聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(25l/ltris，192l/l甘氨酸,20%甲醇)中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后將膜浸沒于含5%脫脂奶粉的tbst液中封閉。抗、抗分別與膜孵育,顯影,nihiage1159計算機軟件分析條帶。1.9數(shù)據(jù)處理計量資料結果以xs表示,進展單因素方差分析,組間均值兩兩比擬用shk法,以上結果

7、均由統(tǒng)計軟件包(spss10.0)完成。2結果2.1川芎嗪對各組腫瘤生長體積的影響川芎嗪各劑量組、魚精蛋白組腫瘤體積均小于生理鹽水組(均p0.05),見圖1。結果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細胞肺癌實體瘤生長有抑制作用。圖1川芎嗪對各組腫瘤生長體積的影響2.2川芎嗪對腫瘤重量及生長抑制率的影響川芎嗪各個劑量組、魚精蛋白組小鼠接種部位的腫瘤重量均低于生理鹽水組(均p0.05)，見表1。實驗結果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細胞肺癌實體瘤生長有抑制作用。表1川芎嗪對腫瘤重量及腫瘤血管生長的影響注：*p0.05，*p0.01vsns2.3川芎嗪對腫瘤細胞vegf表達及腫瘤血管生長的影響圖像分析顯示:v

8、egf主要表達于腫瘤細胞內(nèi),陽性染色的腫瘤細胞多位于浸潤邊緣。血管內(nèi)皮細胞呈弱陽性染色。川芎嗪各劑量組vegf表達都呈現(xiàn)出弱陽性,各組a值與生理鹽水組比擬,差異有顯著性p0.05)，見表2。實驗結果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細胞肺癌細胞表達vegf有抑制作用。圖像分析顯示:腫瘤組織切片中,微血管密集區(qū)多位于腫瘤細胞浸潤的前緣部位。不同劑量的川芎嗪組腫瘤血管密度分級vd值低于生理鹽水組(均p0.05)，見表2。實驗結果顯示:川芎嗪對57bl小鼠小細胞肺癌實體瘤血管生成有抑制作用。表2川芎嗪對腫瘤血管生長的影響注：*p0.05，*p0.01vsns2.4esternblt3討論vegf是一種重要

9、的血管生長因子,對血管內(nèi)皮細胞的增殖、基膜降解、內(nèi)皮細胞遷移和血管構建的調(diào)控作用較強,且特異性高7。研究證明,vegf是腫瘤血管形成的關鍵性介質(zhì)8。無論是rna程度還是蛋白程度,在許多動物和人的惡性腫瘤中都有vegf的高表達;抑制vegf可以抑制腫瘤的生長9。本研究結果顯示,小細胞肺癌細胞可表達vegf，并與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移親密相關。這與同類研究報道一致。不少研究發(fā)現(xiàn),腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能隨著腫瘤微血管密度(vd)的增加而明顯增加10。因此,vd被認為是預測腫瘤轉(zhuǎn)移、復發(fā)和預后的一項重要指標11。本試驗結果再次顯示了,vd升高與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移加快的一致性,并且與vegf表達的升高也有正性相關

10、性。中醫(yī)活血化瘀法及其方藥治療腫瘤有悠久的歷史和確切的療效。對其機制的討論,既往是從抑制腫瘤細胞的增殖、增強免疫等方面進展。川芎為常用的活血化瘀中藥,本試驗再次證明了其主要成分川芎嗪有抗腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。試驗結果還顯示川芎嗪抗腫瘤機制與抑制vegf表達,降卑微血管密度親密相關。這與既往報道川芎嗪增強機體免疫3149-152或誘導腫瘤細胞凋亡494-96而抑制腫瘤生長的機制不同。有關活血化瘀中藥的現(xiàn)代藥理作用研究成果豐碩,但尚未見到有關抑制vegf表達及抗實體瘤血管生長的報道。這一試驗結果打破了既往關于活血化瘀中藥促進缺血壞死組織側(cè)枝循環(huán)的建立,改善心血管功能,改善血液流變學,抗血栓形成,鎮(zhèn)

11、痛、鎮(zhèn)靜、抗炎,抗增生等認識的局限,從一個全新的角度認識了活血化瘀中藥的現(xiàn)代藥理作用。尤其是活血化瘀中藥促進側(cè)枝循環(huán)與抑制新血管生成之間的關系與條件,是否因為詳細藥物而有別,一味中藥是否對于不同病理狀態(tài)可表現(xiàn)出不同的作用等,都有深化研究的必要。許多中醫(yī)診斷為“瘀血的病癥如腫瘤、類風濕性關節(jié)炎、糖尿病血管損害、動脈粥樣硬化等,都有病理性的新血管增生。中醫(yī)均以活血化瘀為主治療,其異病同治的共同機制是否與抑制vegf有關,研究這一問題能從一個角度提醒傳統(tǒng)中醫(yī)治法與方藥的作用本質(zhì)。【參考文獻】1eidnern，seplejp，elhr，etal.turangigenesisandetastasisrr

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