細(xì)胞衰老論文

1、 細(xì)胞衰老概括【引言】人體衰老的實(shí)質(zhì)即為細(xì)胞衰老，當(dāng)前科學(xué)家無不探究著生命的奇跡意欲找出防止細(xì)胞衰老而延緩生命的方式，然而細(xì)胞衰老一方面對人體有著不可替代的作用，領(lǐng)一方面 又不為人們所接受。 【The advantage of cell senescence】1.細(xì)胞衰老可抑制肝臟纖維化 人類繁殖后期（postreproductive）的生命通常與衰退、能力喪失聯(lián)系在一起，細(xì)胞中稱為衰老（senescence）的狀態(tài)，即細(xì)胞衰老與此相似。然而近期來自美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室、霍德華休斯醫(yī)學(xué)院、巴西圣保羅大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)一類特殊的衰老肝臟細(xì)胞能調(diào)控活體小鼠中一系列的生命活動，抑制纖維化（fibrosis

2、）這是肝臟遇到急劇傷害的時(shí)候作出的自然反應(yīng)。 這一驚人的發(fā)現(xiàn)是由這一研究團(tuán)隊(duì)去年將肝臟細(xì)胞衰老與抵抗肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的器官功能聯(lián)系在一起的技術(shù)獲得的。這一研究成果公布在8月22日的細(xì)胞（Cell）1雜志上。 這項(xiàng)研究成果首次證明了細(xì)胞衰老在非癌癥性病理中的特殊作用，CSHL研究小組認(rèn)為這有助于針對一些嚴(yán)重肝臟疾病的前體，譬如肝硬化提出新的治療方法肝硬化是美國第12種最常見的致死疾病。 在2003年Scott W.Lowe博士等人就發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老機(jī)制會讓癌細(xì)胞停止生長，并且他們成功的讓癌細(xì)胞在進(jìn)行治療后處于無法復(fù)制的細(xì)胞衰老階段，并顯現(xiàn)出良好的效果。

3、在那項(xiàng)研究中，研究人員還進(jìn)一步找出了這個(gè)使細(xì)胞停止生長的分子機(jī)制，即細(xì)胞衰老是由于一些特殊的染色體區(qū)域被緊密的包裹在異染色質(zhì)內(nèi)所致。研究人員將這些新發(fā)現(xiàn)的區(qū)域命名為“衰老相關(guān)異染色質(zhì)基因座”（senescenceassociated heterochromatic foci，SAHF）。 去年研究小組又發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)衰老的細(xì)胞衰老能夠有效預(yù)防自發(fā)性癌癥。衰老細(xì)胞有異常染色體，上面攜帶機(jī)能不良的端粒和較短的末端，在腫瘤抑制子p53缺失時(shí)促進(jìn)腫瘤發(fā)生，可能與老年人癌癥高發(fā)性有關(guān)。研究人員認(rèn)為衰老途徑的活化，足夠抑制原發(fā)性腫瘤，說明通過阻止細(xì)胞增殖，p53介導(dǎo)的衰老是抑制衰老細(xì)胞形成腫瘤的一個(gè)重要機(jī)制。

4、而近期Lowe研究小組的有關(guān)肝臟疾病的相關(guān)衰老研究分成了兩個(gè)不同的方向：哪些傷害對于肝臟組織而言是急性，哪些則是慢性，這種對照性的實(shí)驗(yàn)有助于發(fā)現(xiàn)衰老是如何幫助抑制損傷的，以及衰老過程是如何和何時(shí)被肝臟受到的慢性傷害“打垮”的。 在針對第一項(xiàng)的研究中，研究人員對小鼠肝臟施用一種毒素急性傷害，發(fā)現(xiàn)了與之前實(shí)驗(yàn)的一致的結(jié)果：在細(xì)胞纖維化增多之后， 出現(xiàn)肝細(xì)胞死亡（纖維化是小鼠，人類中都存在的應(yīng)對組織損傷的一種天然反應(yīng)）。之后的研究就越來越有趣了，Lowe博士說，“我們觀測到肝臟星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSC）出現(xiàn)增殖激增之后，我們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞為了避免更多纖維化反應(yīng)，最

5、終走向衰老，從肝臟中清除了出去。” 而在慢性傷害的實(shí)驗(yàn)中比如由酒精中毒，慢性肝炎，或者脂肪肝引起的肝臟傷害，研究人員發(fā)現(xiàn)相對于清除，小鼠會產(chǎn)生更多的衰老細(xì)胞，Lowe認(rèn)為，這導(dǎo)致“持續(xù)性炎癥反應(yīng)， 以及增加的纖維化”這是一種在一些病例中導(dǎo)致癌變的狀態(tài)。 從這兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，研究人員認(rèn)為，對于慢性傷害，纖維化如何導(dǎo)致肝硬化是遺傳突變，以及其它引發(fā)肝癌的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)誘導(dǎo)條件（predisposing condition）。而急性傷害實(shí)驗(yàn)則表明未來針對刺激免疫細(xì)胞（靶向纖維損傷的衰老細(xì)胞）的治療，也許對于患有急性肝臟損傷的病患提供一種有效的治療方法，尤其是哪些早期受到了短期毒性成分的影響的肝臟損

6、傷。2.細(xì)胞衰老對腫瘤的促進(jìn)作用 腫瘤是一種典型的年齡相關(guān)性疾病，多在老年人發(fā)生2,3，1961年Hayflick在對體外培養(yǎng)細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有增殖極限的現(xiàn)象，稱之為細(xì)胞衰老。目前研究細(xì)胞衰老大多集中在對細(xì)胞周期機(jī)制、自由基及DNA損傷與衰老的關(guān)系、衰老的端粒學(xué)說、線粒體與衰老、衰老相關(guān)基因和長壽基因、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面。在對腫瘤和衰老的研究中，人們發(fā)現(xiàn)二者的形成過程似乎有一個(gè)此消彼長、相互排斥的關(guān)系，細(xì)胞的衰老可能成為腫瘤形成的天然屏障。大量證據(jù)已經(jīng)顯示，細(xì)胞除了可以通過凋亡或自殺來抑制腫瘤形成外，還可以通過衰老阻止細(xì)胞分裂，進(jìn)而抑制腫瘤(1)細(xì)胞衰老抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要途徑 細(xì)胞衰老抑

7、制腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制主要有兩方面4：端粒途徑，主要依賴于P53信號通路；以積累性應(yīng)激損傷為主的P16RB通路及非端粒途徑的P53通路。研究認(rèn)為5，端粒縮短啟動衰老是ATM/ATRP53P21通路調(diào)節(jié)的DNA損傷反應(yīng)。在衰老機(jī)制中，端粒的作用僅是一方面，除此之外尚存在其他多種非端粒信號通路，如應(yīng)激引起的信號通路、癌基因及有絲分裂原通路等。其中癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老與腫瘤的關(guān)系成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。(2)癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的研究 (2).1 癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的既往研究 Serrano等6通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用HRas(V12)可誘導(dǎo)嚙齒動物和人類細(xì)胞早衰，因?yàn)镽as信號分子存在于RafMekErk通路上，

8、故此通路中的其他信號分子，如Raf、Mek等亦可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。后來Zhu等7在人肺成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過活化Raf1導(dǎo)致了細(xì)胞短暫而不可逆的增殖抑制和早衰反應(yīng)。他們還發(fā)現(xiàn)Raf1引起了RafMekErk激酶級聯(lián)反應(yīng)，其結(jié)果是P16INK4a表達(dá)增加、細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞衰老。后來較多實(shí)驗(yàn)810也證實(shí)了此觀點(diǎn)，即體外培養(yǎng)的細(xì)胞可以在癌基因誘導(dǎo)下發(fā)生衰老。 (2).2 癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的新近研究 由于以前的研究僅限體外細(xì)胞培養(yǎng)，近期報(bào)道3,1115顯示，該方面的研究已經(jīng)深入到體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。Collado等12用KrasV12癌基因在大鼠體內(nèi)復(fù)制了多發(fā)性肺腺瘤及腺癌模型，在腺瘤中檢測到幾種衰老標(biāo)志物，而

9、腺癌中則缺乏。進(jìn)一步他們在皮膚及胰腺組織實(shí)驗(yàn)中，得出了相同結(jié)論，即內(nèi)源性癌基因Ras相關(guān)腫瘤的癌前病變中，有衰老細(xì)胞存在，而相應(yīng)的惡性腫瘤中幾乎沒有衰老細(xì)胞。同時(shí)，用基因芯片對一系列基因進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，這些基因的表達(dá)與ERK蛋白誘導(dǎo)衰老高度相關(guān)，檢測到的衰老相關(guān)分子標(biāo)記有P16INK4a、P15INK4b（CDKN2B）、Dec1（BHLHB2）、Dcr2（TNFRSF10D）以及經(jīng)典的細(xì)胞衰老標(biāo)志物SA Gal（衰老相關(guān)半乳糖苷酶）和HP1(衰老相關(guān)異染色質(zhì)灶)。因此，研究者認(rèn)為，癌基因誘導(dǎo)衰老的效應(yīng)分子P16INK4a或P53存在于癌前病變中，癌組織中則缺失，而且沒有衰老細(xì)胞存在。 BRA

10、F癌基因是MAPK信號傳導(dǎo)通路上Ras下游的傳遞因子，主要存在于神經(jīng)來源的腫瘤組織，如良、惡性黑素細(xì)胞瘤、甲狀腺瘤、卵巢癌等。Michaloglon等13在良性黑素細(xì)胞瘤實(shí)驗(yàn)中，探索衰老與腫瘤的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中，突變基因BRAFV600E可導(dǎo)致短暫的細(xì)胞增殖，隨后引起細(xì)胞衰老及P16表達(dá)增加。這種衰老樣細(xì)胞周期抑制可被病毒癌基因SV40大T抗原所拮抗，其機(jī)制可能與SV40大T抗原使P53或Rb失活有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)痣中的P16表達(dá)具有異質(zhì)性，且其消除對衰老毫無影響，這些細(xì)胞中也沒有明顯的端?？s短現(xiàn)象，這提示在沒有端粒及P16參與的情況下，可能還有其他導(dǎo)致細(xì)胞衰老的機(jī)制存

11、在。 Pten是存在于許多腫瘤中的抑癌基因，在敲除Pten基因的鼠前列腺實(shí)驗(yàn)中，Chen等14發(fā)現(xiàn)在癌前病變或低度惡性腫瘤組織中有衰老標(biāo)志物的表達(dá)，而高度惡性的腫瘤組織則沒有表達(dá)。對這些Pten缺陷的動物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，能使其進(jìn)入衰老狀態(tài)，但又可以被P53失活所逆轉(zhuǎn)，說明Pten缺陷時(shí)P53參與了細(xì)胞衰老抑制腫瘤這一過程。這一結(jié)論與以前發(fā)現(xiàn)的人早期前列腺癌表達(dá)衰老標(biāo)志物，而高度惡性癌不表達(dá)衰老標(biāo)志物相一致。 Suv39h1是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，在衰老細(xì)胞中可以使促生長基因的異染色質(zhì)沉默。Braig等15在持續(xù)表達(dá)致瘤性Ras（EuNRas ）的EuNRas鼠淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤細(xì)胞對化療

12、藥表現(xiàn)出衰老反應(yīng)，而當(dāng)Suv39h1缺陷時(shí)，則未見衰老反應(yīng)。因此證實(shí)，Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老可以抑制淋巴瘤的形成和發(fā)展，但必需Suv39h1的參與。而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Rb促細(xì)胞衰老過程中，亦需Suv39h1參與，如果其缺陷，Rb則不能促進(jìn)細(xì)胞衰老，可能與生理情況下Suv39h1與Rb結(jié)合導(dǎo)致DNA包裝異常有關(guān)。以往實(shí)驗(yàn)1215中研究者均發(fā)現(xiàn)，癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老主要存在與癌前病變中，它可以阻止癌前病變向惡性腫瘤進(jìn)展，進(jìn)一步證實(shí)，癌基因活化后可誘導(dǎo)癌前病變中的細(xì)胞衰老，細(xì)胞衰老可以做為防止細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展的有效途徑。另外，衰老是有分子異質(zhì)性的，對于不同的刺激物，不同類型的細(xì)胞，細(xì)胞衰老將經(jīng)

13、歷不同的途徑。(3)臨床方面 臨床上也有關(guān)于細(xì)胞衰老與腫瘤關(guān)系的一些研究，如Poele16等對曾進(jìn)行過化療的乳腺癌患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，SA Gal、P53及P16INK4a表達(dá)均增高，而在未經(jīng)化療藥物治療的腫瘤組織及瘤周正常組織中表達(dá)相對較低。之后，Roberson等在實(shí)驗(yàn)中亦證實(shí)了此觀點(diǎn)。臨床研究表明，腫瘤細(xì)胞中的不同衰老調(diào)控基因的表達(dá)對應(yīng)了不同的預(yù)后，清楚的了解這些基因表達(dá)情況及其調(diào)控機(jī)制將有助于制定新的腫瘤化療方案，以提高治愈率和降低副作用。(4)癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老抑制腫瘤的主要機(jī)制 癌基因誘導(dǎo)衰老主要涉及兩個(gè)細(xì)胞信號通路，ARFP53P21和P16INK4aRb通路1

14、1。p53和Rb基因是最重要的兩個(gè)抑癌基因，也是最主要的衰老調(diào)控因子。既往研究肯定了P53能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡，新近研究顯示，高度活化的p53也可以促進(jìn)細(xì)胞衰老18。許多研究認(rèn)為，P53在促進(jìn)細(xì)胞衰老中可以上調(diào)P21,后者通過抑制CDK2/Cyclin E及CDK4/Cyclin Ds等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的活性來抑制細(xì)胞增殖。另外，CDKs的活性抑制還可以引起pRB的低磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞衰老。調(diào)節(jié)P53的因子很多19，正性調(diào)節(jié)因子如ARF（在人和鼠分別是P14ARF和P19ARF）、PML、PTEN、NPM及P33ING1，負(fù)性調(diào)節(jié)因子有E3泛素連接酶MDM2、PIRH2和COP1。除p53外，

15、Rb也是調(diào)節(jié)衰老的一個(gè)重要因子，但此方面的研究相對較少。但目前已知，上調(diào)Rb的因子包括P16INK4a和上游調(diào)控分子Bmi1、CBX7、ID1、Tts119，下調(diào)因子有P21及P27等9。(5)細(xì)胞衰老對腫瘤的促進(jìn)作用 拮抗性多效（antagonistic pleiotropy）進(jìn)化理論認(rèn)為，衰老在早期可以保護(hù)機(jī)體不致于發(fā)生腫瘤，而到老年期則促進(jìn)衰老表型，促使腫瘤形成1。細(xì)胞分裂達(dá)到一定限度時(shí)，就進(jìn)入衰老階段。盡管衰老的細(xì)胞不能像正常細(xì)胞一樣增殖，但是它們?nèi)匀槐３种x活性，并且還可以產(chǎn)生具有抑制和促進(jìn)腫瘤生長的活性蛋白質(zhì)。衰老細(xì)胞隨著增齡而積累，產(chǎn)生胞外基質(zhì)重構(gòu)酶、炎性細(xì)胞因子及上皮生長因子

16、等。這些因子能夠破壞局部組織微環(huán)境、刺激鄰近細(xì)胞增殖和惡性進(jìn)展，較多研究2023都證實(shí)了此觀點(diǎn)。所以腫瘤的發(fā)生既可因衰老不足，也可因衰老過度而發(fā)生，如何平衡兩者之間的矛盾，值得進(jìn)一步深入研究。 癌前病變是一個(gè)細(xì)胞病理學(xué)概念，是一類具有細(xì)胞不典型性和分化異常的增生性病變。癌前病變具有和腫瘤相類似的生物學(xué)特征，如基因異常改變、細(xì)胞凋亡功能失常和細(xì)胞表型異常，因此，它有發(fā)展成腫瘤細(xì)胞的潛在趨勢。但是，與惡性腫瘤不同，癌前病變?nèi)匀粚儆诹夹圆∽?，并且可以停止發(fā)展、甚至逆轉(zhuǎn)。癌前病變的一個(gè)顯著特征是由癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，給腫瘤發(fā)展過程設(shè)置了障礙。而當(dāng)機(jī)體發(fā)展到惡性腫瘤后，似乎衰老已經(jīng)無能為力。因此對癌前

17、病變中細(xì)胞衰老的研究尤為重要，對腫瘤的防治將有深遠(yuǎn)意義。衰老標(biāo)志物可作為腫瘤早期標(biāo)志物，對這些標(biāo)志物的檢測將有助于腫瘤的分子病理學(xué)診斷。但是，在復(fù)雜的研究背后，仍然存在一些問題，如癌基因可以誘導(dǎo)衰老也可以導(dǎo)致癌前病變，但是其導(dǎo)致癌前病變早還是引起衰老更早，即二者孰因孰果值得探究，甚至是否可以認(rèn)為腫瘤本身就是衰老的一種表現(xiàn)癌前病變，只有少數(shù)發(fā)展為惡性腫瘤，而大部分將處于靜止或逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞衰老如何影響它們的轉(zhuǎn)歸，這些問題都值得進(jìn)一步研究探討?！綯he study concerned with cell senescence】1.天然腦活素促細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞衰老作用 衰老（senescence）是細(xì)胞

18、的重要生命現(xiàn)象之一，絕大多數(shù)正常細(xì)胞被認(rèn)為僅有有限的分裂能力，當(dāng)其經(jīng)過一定的倍增之后，將進(jìn)入終末增殖狀態(tài)，稱為細(xì)胞衰老。一般來講，人類胚胎的成纖維細(xì)胞在達(dá)到衰老時(shí)，能夠復(fù)制 50 代左右（Population Doublings, Pds），由于這種衰老是由分裂傳代而達(dá)到的，故又稱之為復(fù)制性衰老（replicative senescence）24。探討細(xì)胞衰老的分子機(jī)理是人類認(rèn)識自我研究的重要組成部分，從分子水平研究衰老過程中基因及調(diào)控變化，已成為目前衰老機(jī)理研究的主要方向，同時(shí)研究開發(fā)延緩衰老的藥物將為提高人類生存質(zhì)量提供重要保證，也為衰老相關(guān)疾病的防治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 天然腦活素為

19、結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代藥效學(xué)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化篩選而成，在以往基礎(chǔ)上以人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞（MRC-5）為研究對象，觀察天然腦活素對 MRC-5 細(xì)胞表型、細(xì)胞代齡、傳代速度、細(xì)胞生長增殖能力及衰老相關(guān)指標(biāo)的影響，探討其延緩 MRC-5 細(xì)胞復(fù)制性衰老的作用及其機(jī)理。 光鏡下觀察 MRC-5 細(xì)胞衰老表型，常規(guī)計(jì)數(shù)細(xì)胞代齡、傳代速度， MTT 法檢測細(xì)胞增殖活度，X-Gal 染色法觀察細(xì)胞衰老情況，計(jì)數(shù)衰老細(xì)胞百分率。 結(jié)果顯示：天然腦活素可維持細(xì)胞的非衰老表型，增加 MRC-5 細(xì)胞代齡，天然腦活素 孵育 MRC-5 細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力較空白老齡對照組明顯升高（P 0.05），細(xì)胞的增殖速度顯著加快

20、。另外，天然腦活素連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞在老齡階段衰老細(xì)胞數(shù)顯著低于老齡對照細(xì)胞（P 0.01）。初步證實(shí)天然腦活素可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖速度，進(jìn)而延緩 MRC-5 細(xì)胞的復(fù)制性衰老，為中藥延緩衰老開辟了新的研究途徑。 絕大多數(shù)正常人類細(xì)胞在體外組織培養(yǎng)的序列傳代過程中，逐漸喪失其增殖傳代的能力，最終達(dá)到一種不可逆的增殖停滯狀態(tài)，并可保持代謝活力的穩(wěn)定，能夠維持?jǐn)?shù)月甚至數(shù)年。這種似乎是無限期的增殖停滯狀態(tài)被命名為衰老（senescence），而細(xì)胞達(dá)到衰老狀態(tài)時(shí)的傳代次數(shù)稱為壽限24，25。衰老是由細(xì)胞所經(jīng)歷的傳代次數(shù)決定的，而與時(shí)間無關(guān)。體外細(xì)胞的衰老與體內(nèi)組織的衰老有直接的相關(guān)性26，27 人二倍體成

21、纖維細(xì)胞（human diploid fibroblasts, HDFs）一般沒有端粒酶活性，所以當(dāng)端粒 DNA 長度丟失達(dá)到臨界長度時(shí)，染色體變形急劇增加，染色體間發(fā)生融合， 細(xì)胞不再增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡28，故常常被作為衰老研究的理想模型。衰老細(xì)胞除了不能復(fù)制傳代之外，還表現(xiàn)出一系列生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和多種分子生物學(xué)的改變，如形態(tài)大小不規(guī)則，胞漿內(nèi)顆粒性物質(zhì)累積，細(xì)胞排列散亂，培養(yǎng)基中多見細(xì)胞碎片，細(xì)胞失去融合能力、縫隙連接減少等2931。 天然腦活素作用于正常衰老型成纖維細(xì)胞，通過測定衰老細(xì)胞的百分比，與老齡對照組細(xì)胞相比衰老細(xì)胞數(shù)目明顯減少，衰老細(xì)胞百分比顯著降低，提示天然腦活素可

22、延緩衰老細(xì)胞的群體死亡的發(fā)生，從而延長細(xì)胞的體外壽命?？傊禾烊荒X活素可升高 MRC-5 細(xì)胞增殖能力，有效延緩細(xì)胞的復(fù)制性衰老。2.線粒體與衰老的關(guān)系 線粒體作為真核細(xì)胞中一種重要而獨(dú)特的細(xì)胞器,其性狀改變與人的衰老和疾病密切相關(guān),甚至被稱為衰老的生物鐘。自1989年Linnane等提出線粒體衰老假說以來,人們越來越關(guān)注線粒體與衰老的關(guān)系。 因線粒體一些特有的特點(diǎn),如生命周期有限,具有高的更新率;形態(tài)、大小、數(shù)量和分布,常因細(xì)胞種類不同而異;線粒體DNA(mtDNA)與核DNA不同,是多拷貝的且具有異質(zhì)性等,到目前為止,雖對衰老中線粒體的改變有一些研究報(bào)道,但結(jié)果并不一致,缺乏較系統(tǒng)的研究。

23、關(guān)于人衰老中線粒體的一些變化并無定論,線粒體衰退與機(jī)體的衰老二者的因果關(guān)系也有待于進(jìn)一步探討。機(jī)體的衰老來源于細(xì)胞的衰老,對二倍體細(xì)胞的研究有助于衰老機(jī)理的探討。通過對二倍體細(xì)胞衰老中線粒體變化的研究,有助于探討線粒體與衰老的關(guān)系,進(jìn)一步弄清線粒體在衰老中的作用。這些研究將對衰老指標(biāo)的測定,抗衰老藥物研究及措施的評估有重要意義。通過建立細(xì)胞衰老模型,從二倍體細(xì)胞衰老過程中量與功能變化相結(jié)合來探討線粒體與衰老的關(guān)系。 一.人胚肺二倍體細(xì)胞W1-38的培養(yǎng) 近年來應(yīng)用人胚肺二倍體細(xì)胞W1-38作為衰老研究的體外模型,己得到了國內(nèi)外研究工作者的肯定。細(xì)胞從20代傳至約50代;定期凍存;隔期拍照記錄生

24、長狀態(tài);計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù);MTT測定細(xì)胞活力。 觀察發(fā)現(xiàn),年輕細(xì)胞平均兩天呈致密單層,細(xì)胞長梭形,排列成束狀,折光度好,立體感強(qiáng);每瓶細(xì)胞數(shù)為68105;衰老細(xì)胞形成單層時(shí)間明顯延長,細(xì)胞圓縮蛻變,可呈菱形、三角形,折光度下降;每瓶細(xì)胞數(shù)為46105。晚期細(xì)胞活力明顯低于早期。 二.衰老中線粒體質(zhì)和量改變的研究 線粒體形態(tài)因外界環(huán)境和功能改變而異,線粒體形態(tài)變化可作為衰老研究的參考之一。收集固定細(xì)胞,制成切片,電鏡觀察線粒體三維結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。線粒體的數(shù)量在不同細(xì)胞中差異很大,同時(shí)與細(xì)胞的功能狀態(tài)是相關(guān)的。3.皮膚衰老與細(xì)胞衰老 皮膚衰老是機(jī)體衰老的重要外在表現(xiàn)之一，已引起老年學(xué)和皮膚科學(xué)的重視。體

25、外的皮膚細(xì)胞衰老可部分反映機(jī)體皮膚老化狀況。同時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚衰老中的作用也逐漸引起人們的重視，因?yàn)楸砥そ琴|(zhì)形成細(xì)胞在皮膚衰老過程中的重要作用如同真皮成纖維細(xì)胞一樣日益受到關(guān)注。加速有關(guān)皮膚衰老的研究可為闡明皮膚衰老機(jī)制、為老年皮膚病學(xué)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥和皮膚疾病的防治。 衰老是指隨著時(shí)間的推移所有個(gè)體都將發(fā)生的功能性和器質(zhì)性衰退的漸進(jìn)過程。這種退行性變化可歸因于內(nèi)源性(基因調(diào)控)和個(gè)體反復(fù)暴露于環(huán)境中各種有害因素的綜合作用的結(jié)果32。人們對系統(tǒng)器官方面的衰老表象研究較多，已引起老年學(xué)研究工作者的重視。 (1)皮膚衰老衰老是指機(jī)體器官對環(huán)境改變適應(yīng)性隨年歲增長逐漸下降，

26、進(jìn)而易患疾病或引起死亡。衰老部分是由機(jī)體預(yù)定的基因程序進(jìn)行調(diào)控的；部分由內(nèi)外：“磨損和消耗”所引起，同時(shí)表現(xiàn)于細(xì)胞和分子水平。皮膚可為研究衰老提供良好的場所，因?yàn)樗鼫\表外露，有利于在分子和細(xì)胞水平上研究機(jī)體的衰老32,33。皮膚衰老主要為自然衰老和光老化兩種形式，所謂自然衰老(intrinsic aging)系指由于機(jī)體內(nèi)在因素的作用(主要為遺傳因素)引起，見于暴露部位和非暴露部位，明顯特征為皺紋的出現(xiàn)和皮膚的松弛。而光老化(photoaging)則指皮膚衰老過程紫外線損害的積累，是自然老化和紫外線輻射共同作用的結(jié)果，表現(xiàn)為皮膚暴露部位粗燥、皺紋加深加粗、結(jié)構(gòu)異常、不規(guī)則性色素沉著、血管擴(kuò)張、

27、表皮角化不良、出現(xiàn)異常增殖、真皮彈力纖維變性及降解產(chǎn)物蓄積等33,34。由此可見，自然衰老與光老化有一定的差異。皮膚衰老表現(xiàn)為表皮更新減慢、屏障功能減弱、角質(zhì)形成細(xì)胞活力下降、表皮受傷后修復(fù)能力減弱。具體而言，表皮厚度改變不明顯，但角質(zhì)層的屏障功能下降：表皮使用50的氫氧化氨處理，則衰老皮膚產(chǎn)生小水皰為特征的初始反應(yīng)時(shí)間縮短。表皮持續(xù)更新并維持機(jī)體與環(huán)境聯(lián)系，以保持機(jī)體結(jié)構(gòu)的完整。在完整的表皮，基底角質(zhì)形成細(xì)胞中的角蛋白中間絲與基底層的致密斑相連。中間絲插入到具有大皰抗原(BP230、BP180)高密度的半橋粒致密斑中，半橋粒富含層粘蛋白和Nidogen，發(fā)出錨定纖維(anchoring fi

28、brils)平鋪在透明層，直達(dá)致密層。致密層中富含型膠原和硫酸乙酰皮膚素，通過型膠原的錨定作用與間質(zhì)膠原纖維相連。角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)歷復(fù)雜而又是預(yù)定的程序進(jìn)行分化35。如果此過程出現(xiàn)障礙，則導(dǎo)致機(jī)體各種各樣功能減弱，衰老過程中由于自由基及過氧化作用使膠原表面形成AGE(終末糖化產(chǎn)物)而過度交聯(lián)，使皮膚半橋粒結(jié)構(gòu)失去彈性，表皮真皮連接變平，皮膚變得松弛、失去彈性3436。真皮衰老表現(xiàn)為真皮對外來化學(xué)物清除力下降，真皮厚度變薄、膠原蛋白和彈性蛋白合成減少、分解增加，分解酶活性增強(qiáng)。皮膚作為重要的代謝器官，衰老時(shí)許多代謝酶類活性下降32,34。另外，、型膠原比值在衰老過程中逐漸倒置，膠原逐漸變粗、出現(xiàn)異

29、常交鏈，主要?dú)w因于衰老有關(guān)的組氨酸、丙氨酸交鏈鍵增加，同時(shí)非酶糖化的增多也是引起膠原異常交鏈出現(xiàn)的原因之一。真皮厚度變薄，膠原含量減少，特別是可溶性膠原含量下降明顯，彈性蛋白含量上升；胞外間質(zhì)中透明質(zhì)酸和硫酸皮膚素含量明顯下降，糖胺多糖總含量下降。此外，膠原纖維和彈性纖維排列也漸趨紊亂。其生理結(jié)局使老年皮膚失去增殖能力，其抗剪切力減弱。郎格漢斯細(xì)胞和黑素細(xì)胞數(shù)目明顯下降、脂褐質(zhì)明顯增加，呈現(xiàn)出老年斑和 其他色素沉著癥狀。皮膚衰老也表現(xiàn)在皮膚功能方面，如溫度調(diào)節(jié)、受傷后表皮重建能力、免疫反應(yīng)、感覺能力、汗腺和皮脂腺分泌、維生素D3合成能力和血管反應(yīng)性等多方面功能降低，這樣導(dǎo)致老年人對紫外線、變應(yīng)

30、原敏感，它們不僅是皮膚衰老的結(jié)果，反過來也進(jìn)一步促進(jìn)皮膚衰老3234。皮膚衰老的機(jī)制非常復(fù)雜27。在細(xì)胞、分子水平，可表現(xiàn)為染色體端粒縮短，DNA甲基化水平下降，EGF等生長因子及其受體或其它生長、抑制相關(guān)基因(如RB、fos、jun、GADD153)數(shù)量、功能的變化，對外界反應(yīng)性逐漸降低，皮膚細(xì)胞增殖分化能力進(jìn)而減弱、新陳代謝減緩，皮膚呈現(xiàn)出衰老外貌。 (2)皮膚細(xì)胞衰老皮膚表象的衰老反映在細(xì)胞水平即為細(xì)胞衰老(cell senescence)，細(xì)胞衰老是指正常細(xì)胞只有一定的生命周期而不能進(jìn)行無限增殖。衰老細(xì)胞具有下列特征38,39：細(xì)胞衰老的明顯特征是細(xì)胞內(nèi)容物、代謝和形態(tài)學(xué)改變。衰老細(xì)胞

31、盡管喪失合成DNA和細(xì)胞增殖能力，但仍具有一定代謝活性。細(xì)胞變大、核增大，蛋白含量、脂質(zhì)、核RNA含量增加，同樣胞外基質(zhì)也增加。細(xì)胞衰老是一種優(yōu)勢現(xiàn)象，年輕細(xì)胞和年老細(xì)胞的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)證實(shí)衰老占主要過程，即雜合子細(xì)胞表現(xiàn)為衰老細(xì)胞，其可能的原因?yàn)槟昀霞?xì)胞的細(xì)胞因子或其他成分阻止年輕細(xì)胞合成DNA，使細(xì)胞的生長停止。人們得出結(jié)論衰老細(xì)胞的生長停止是一種由衰老有關(guān)基因事先決定的現(xiàn)象。細(xì)胞衰老是一種不可逆的過程。除非用腫瘤病毒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化則可逆轉(zhuǎn)，少數(shù)細(xì)胞渡過一定的“危機(jī)”之后被轉(zhuǎn)化變成不死細(xì)胞。這表明細(xì)胞衰老是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的逆過程，與終末分化相類似。衰老細(xì)胞不能進(jìn)行DNA合成而導(dǎo)致生長的停止，這樣人

32、們推斷衰老 細(xì)胞中存在DNA合成抑制因子。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，皮膚細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間長短和增殖速率與供體的年齡成反比32,34,40。同時(shí)表現(xiàn)在對外界有絲分裂原的反應(yīng)性、克隆形成能力和產(chǎn)生自體和旁分泌生長因子能力下降 ，對其抑制信號反應(yīng)(如干擾素)增強(qiáng)。(2).1成纖維細(xì)胞衰老因?yàn)槌衫w維細(xì)胞具有易獲取、易培養(yǎng)的特點(diǎn)，在皮膚衰老中研究較多。許多體外實(shí)驗(yàn)研究表明，成纖維細(xì)胞在衰老過程中I型膠原表達(dá)減少，其中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)起十分重要的作用。隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，I型膠原和TGFmRNA表達(dá)均下降62，TGF受體、的mRNA表達(dá)下降59，TGF與受體結(jié)合力也隨之下降41。同時(shí)衰老細(xì)胞中間質(zhì)膠原酶(

33、MMP1)、間質(zhì)溶解酶(MMP3)的誘導(dǎo)能力上調(diào)，引起膠原等間質(zhì)蛋白分解增強(qiáng)42。衰老的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的Fas蛋白表達(dá)增加23倍，導(dǎo)致 凋亡的發(fā)生。有關(guān)光老化方面的結(jié)果也與此一致，老年人來源的比年輕人的來源的細(xì)胞、新生兒來源的比年輕人來源的細(xì)胞、太陽暴露部位比非暴露部位來源的細(xì)胞的體外倍增次數(shù)明顯減少、對生長因子等生長刺激因素的反應(yīng)力減弱、細(xì)胞表面的受體也減少、配體受體結(jié)合后磷酸化能力也減弱等等33,43。有研究報(bào)道44，UVA作用于成纖維細(xì)胞后使IL1的表達(dá)增加，誘導(dǎo)IL6的表達(dá)增多，從而導(dǎo)致間質(zhì)膠原酶的分泌增加，引起皮膚間質(zhì)膠原的分解增多，在光老化中起十分重要的作用。(2).2角質(zhì)形成細(xì)胞

34、衰老人們在研究機(jī)體衰老和皮膚衰老時(shí)，多側(cè)重于皮膚成纖維細(xì)胞衰老的研究。近年來，逐步認(rèn)識到角質(zhì)形成細(xì)胞在皮膚衰老中也起著十分重要的作用。角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)可在體外進(jìn)一步分化方法的成功建立以及分子生物學(xué)的發(fā)展，可提供純的角質(zhì)形成細(xì)胞來進(jìn)行增殖和分化因子的研究，并可分離和純化這些蛋白質(zhì)和基因。體內(nèi)外角質(zhì)形成細(xì)胞突變蛋白的研究可為探明衰老的發(fā)生和諸多皮膚病的成因提供新的思路和方法。增殖僅限于表皮的基底層，但隨著細(xì)胞從基底層向顆粒層、角質(zhì)層推進(jìn)過程中進(jìn)行分化。分化過程與許多蛋白質(zhì)的改變有關(guān)。K5、K15角蛋白表達(dá)見于基底層，而在顆粒層為K1、K10 形成角質(zhì)包裹層45。角質(zhì)形成細(xì)胞自然衰老時(shí)，分化相關(guān)的S

35、PR2(一種富含脯氨酸小分子蛋白)和IL1ra(白介素1受體拮抗物，具有競爭性抑制IL1、的作用)基因表達(dá)顯著增加，原癌基因cfos基因表達(dá)減少46。培養(yǎng)的新生兒角質(zhì)形成細(xì)胞cfos基因表達(dá)很弱，經(jīng)生長因子刺激后迅速和大量表達(dá)；成人角質(zhì)形成細(xì)胞也能誘導(dǎo)，但其強(qiáng)度弱得多。同樣cmyc基因在40歲以上年齡者的表達(dá)水平比新生兒和年輕人表達(dá)低，EGFr(表皮生長因子受體)的mRNA在新生兒中刺激前也表達(dá)，且經(jīng)刺激后表達(dá)迅速增加，成人細(xì)胞增加不明顯。GADD(Growth arrest and DNA damage gene)基因mRNA在各種培養(yǎng)細(xì)胞中都表達(dá)，刺激后2小時(shí)新生兒的下調(diào)水平比成人大，成人

36、角質(zhì)形成細(xì)胞在加入生長因子后14小時(shí)表達(dá)迅速增加并達(dá)最高水平，而新生兒生長因子刺激后24小時(shí)才表達(dá)，48小時(shí)達(dá)到高峰47。可見在角質(zhì)形成細(xì)胞衰老過程中增殖有關(guān)的 基因表達(dá)遲緩，而損傷有關(guān)基因表達(dá)增加。機(jī)體皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞在紫外線照射后，fasmRNA及其蛋白質(zhì)表達(dá)增加、且維持時(shí)間延長，這些結(jié)果表明fas系統(tǒng)在皮膚光老化過程中起著十分重要的作用。光老化過程中cfos基因的誘導(dǎo)增加；而此基因在自然老化過程中表達(dá)減少。光老化進(jìn)程中IL1ra表達(dá)下降，在自然老化時(shí)增加。細(xì)胞分裂相關(guān)基因SP R2誘導(dǎo)也減少，自然老化時(shí)增加48,49。角質(zhì)形成細(xì)胞衰老在皮膚衰老中的作用已越來越受到人們的重視，因?yàn)樗谄つw

37、保水、保濕、屏障以及皮膚病形成等多方面具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。角質(zhì)形成細(xì)胞衰老的基因表達(dá)改變明顯，首先，G蛋白亞單位的活性和構(gòu)成有變化，然后通過PKC、PTK等信號傳導(dǎo)途徑，影響原癌基因/抑癌基因的表達(dá) ，最后影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化?？傊?，皮膚衰老的研究，特別是有關(guān)皮膚自然衰老的研究并不深入，對其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)理了解不多。皮膚衰老的預(yù)防和治療僅僅以維甲酸為主，應(yīng)當(dāng)承認(rèn)維甲酸在治療皮膚光老化和角質(zhì)過度增生性疾病具有一定的效果，可以降低皮膚表面的粗糙度、減少皺紋、降低皮膚的色素沉著，在組織學(xué)上可 增加顆粒層的細(xì)胞層數(shù)、增加表皮厚度50。但是對皮膚的自然衰老療效不顯著。加速有關(guān)皮膚衰老的研究不

38、僅可以闡明皮膚衰老的機(jī)制，同時(shí)也為老年皮膚病學(xué)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)，可進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥和皮膚疾病的預(yù)防。4.雙歧桿菌脂磷壁酸延緩細(xì)胞衰老的作用機(jī)制 為了探討雙歧桿菌脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）在延緩H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中的作用，用H2O2誘導(dǎo)WI 38細(xì)胞衰老，半乳糖苷酶細(xì)胞化學(xué)染色計(jì)算衰老細(xì)胞百分率變化，RTPCR和Western印跡檢測衰老細(xì)胞p21、細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）和周期蛋白依賴性蛋白激酶2（CDK2）表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌LTA處理后，半乳糖苷酶細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞百分率較衰老模型組降低（P0.01)。與年輕對照組相比，衰老模型組細(xì)

39、胞中p21的表達(dá)增高，cyclin E和CDK2表達(dá)降低，而雙歧桿菌LTA能夠逆轉(zhuǎn)上述變化（P0.01)。因此，雙歧桿菌能延緩H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老,機(jī)制可能與改變p21，cyclin E和CDK2表達(dá)水平有關(guān)。 在體外，人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞已成為經(jīng)典的復(fù)制性細(xì)胞衰老模型，而多種刺激物能誘導(dǎo)年輕細(xì)胞出現(xiàn)與復(fù)制性衰老相似的特征，被稱為應(yīng)激誘導(dǎo)早熟性老化(stressinduced premature senescence，SIPS)，其中H2O2是最常用的氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞SIPS誘導(dǎo)劑 51，52。雙歧桿菌的表面分子脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)已被證實(shí)具有抗氧化的作用

40、，能夠有效延緩衰老53，但其機(jī)制并不是很清楚。用H2O2誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞WI 38出現(xiàn)SIPS,觀察雙歧桿菌LTA是否具有抗細(xì)胞衰老的作用，以及WI 38細(xì)胞中p21、CDK2和cyclin E mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，探討出雙歧桿菌LTA抗細(xì)胞衰老的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。 氧化應(yīng)激是指機(jī)體活性氧的產(chǎn)生過多或(和)機(jī)體抗氧化能力下降，活性氧(ROS)清除不足，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)增多并引起細(xì)胞氧化損傷的病理過程。ROS包括超氧陰離子(O2)、羥自由基(OH)、H2O2等。在體外,H2O2引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,是最常用的誘導(dǎo)劑。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用亞致死量的160 mol/L H2

41、O2處理WI38細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞SIPS，其半乳糖苷酶細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞百分率較年輕對照組明顯增高,而用雙歧桿菌LTA處理后，半乳糖苷酶陽性細(xì)胞百分率較模型組明顯降低，其中尤以5 、10 g/ml雙歧桿菌LTA處理組降低最為明顯，而20 g/ml雙歧桿菌處理組無明顯變化，顯示出一定的濃度依賴性，表明雙歧桿菌LTA能延緩H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。 細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，細(xì)胞在周期時(shí)相的變遷中進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。細(xì)胞周期沿著G1期S期G2期M期的順序進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)。G1期是啟動細(xì)胞周期循環(huán)的關(guān)鍵，當(dāng)細(xì)胞復(fù)制性衰老時(shí)，生長停滯，主要分布在G1期。當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)衰老時(shí)，也具有相同的

42、特征。Gorbunova等54認(rèn)為H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老主要是由于DNA損傷引起。對DNA損傷所引起的反應(yīng)細(xì)胞阻滯于G1期。在整個(gè)G1期，細(xì)胞在不同時(shí)相受到各自周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴激酶(CDK)的凋節(jié)，其中cyclin E是調(diào)控細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵。cyclin E首先激活CDK2，cyclin ECDK2的磷酸化活性使Rb磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)行有序的運(yùn)轉(zhuǎn)。因此，提高cyclin E和CDK2的表達(dá)，可以促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。而抑制CDK2的活性，也能阻止細(xì)胞進(jìn)入S期55。p21作為一個(gè)廣譜的CDK抑制劑和細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，能抑制cyclin ECDK2的磷酸化活性，使細(xì)胞停滯在G1期，從而誘發(fā)細(xì)胞衰老的特征性改變56。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的WI38細(xì)胞出現(xiàn)SIPS，其細(xì)胞中p21表達(dá)明顯增加，cyclin E和CDK2