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1、斑點(diǎn)印跡雜交 掌握斑點(diǎn)印跡雜交的原理及方法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾s交:具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等)可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈,此雜交過(guò)程是高度特異的。雜交的雙方是待測(cè)核酸及探針。斑點(diǎn)雜交:是指將待測(cè)的DNA變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜(或尼龍膜)上,用已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交,洗膜(除去未結(jié)合的探針),顯影,判斷是否有雜交或其雜交強(qiáng)度,主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測(cè)。根據(jù)點(diǎn)樣磨具不同,點(diǎn)樣形狀呈圓形稱為斑點(diǎn)雜交,呈狹縫形則稱為狹縫雜交。實(shí)驗(yàn)原理 斑點(diǎn)印跡雜交不需要電泳和轉(zhuǎn)移,雜交過(guò)程包括變性,點(diǎn)樣,中和,干燥固定,預(yù)雜交,雜交,封閉,檢測(cè)雜交結(jié)果等步驟,相對(duì)southern
2、印跡雜交和Northern印記雜交來(lái)說(shuō)快,適合于同時(shí)分析多個(gè)樣品。實(shí)驗(yàn)步驟:變性:按8:1將80ul ddH2O加入至10ul待測(cè)DNA樣品中,稀釋樣品。100加熱10min后,立即置于冰中5min(使DNA變性),加入90ul 20SSC混勻。點(diǎn)樣:將上述變性后的樣品180ul點(diǎn)在尼龍膜的毛面上,真空抽濾,室溫下風(fēng)干后,于烤箱中120烘烤15min。使變性的DNA與膜結(jié)合牢固預(yù)雜交:將膜放入15ml離心管中,做好剪角標(biāo)記(剪H角,剪角位于左下角時(shí)為正)。加入預(yù)雜交液3ml。置42恒溫?fù)u床上,輕輕振搖30min。封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)雜交:將5UL探針(生物素-DNA)加入預(yù)
3、雜交液中,置42 恒溫床上,輕輕振蕩1h。變性DNA與探針結(jié)合5 洗膜:倒掉雜交液,洗液1(每次5ml)洗膜三次(洗液1預(yù)熱到42),每次5min;再將洗液2 (每次5ml)洗膜兩次(預(yù)熱到42),每次15min。洗去未結(jié)合的探針,否則本底會(huì)太高6 封閉:倒掉洗液2,加入5ml封閉液,37作用15min。封閉雜交膜上非特異性的蛋白結(jié)合位點(diǎn)7 酶聯(lián)抗體結(jié)合:倒掉封閉液,加入3ml親和素-辣根過(guò)氧化物酶(HRP),于37輕輕振搖30min。酶聯(lián)抗體與生物素結(jié)合8 洗膜:倒掉第七步驟中液體,加入5ml洗液3,洗膜三次,每次2-3min。洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體9 顯色:洗膜后,加3ml的顯色液避光顯色1-2min,斑點(diǎn)出來(lái)后就可倒掉顯色液,用ddH20沖洗幾次,終止顯色。A4A5A6B4B5C4C5D4D5E4E5F4F5G4G5H
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