化學(xué)生物學(xué)中的探針標(biāo)記技術(shù)-20150318課件

1、Lecture 2化學(xué)生物學(xué)中的探針標(biāo)記技術(shù)探針標(biāo)記Target identificationNucleic acidsProteinsSequence- specific Sequence- nonspecific Intercalating dye Complementary oligomers, molecular beacon GeneticlabelingImmunolabelingEnzymesubstrate蛋白熒光標(biāo)記具有靈敏度高、選擇性好、動態(tài)響應(yīng)范圍寬以及測定條件更接近生命體的生理環(huán)境等優(yōu)點。蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記的重要性蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的執(zhí)行者，在許多情況下，一個細(xì)胞功能的實現(xiàn)是

2、多個蛋白質(zhì)分子相互作用的結(jié)果。許多重要的生命過程，如多亞單位蛋白質(zhì)復(fù)合體形成、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)修飾和降解等，都依賴于蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用。可視化、表達(dá)、定位、相互作用Target probe generationNucleic acid-based affinity molecules: nucleic acid aptamersPeptide- or protein-based affinity molecules: antibodies and antibody-like proteinsIn vitro SELEX(Systematic Ev

3、olution of Ligands by Exponential Enrichment)指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化探針獲取Natural Human Antibody and Its FragmentsNature Biotechnology, 2005, 23, 1126. 單鏈抗體抗原結(jié)合片段antigen-binding fragmentScience, 312, 217-224 (2006).Science, 312, 217-224 (2006).2008年諾貝爾化學(xué)獎揭曉2008年10月8日，瑞典皇家科學(xué)院在瑞典首都斯德哥爾摩宣布，日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁沙爾菲和美籍華裔科學(xué)

4、家錢永健因在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白方面做出貢獻(xiàn)而分享今年的諾貝爾化學(xué)獎。 OsamuShimomura（下村修） MartinChalfie馬丁沙爾菲RogerY.Tsien錢永健GFP的生物應(yīng)用綠色熒光蛋白是當(dāng)代科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的工具之一，它從顯微水平上照亮了生命。通過DNA技術(shù)，研究人員現(xiàn)在能夠?qū)FP和其他有趣但卻不可見的蛋白聯(lián)系起來。發(fā)光標(biāo)記使科學(xué)家能夠觀察蛋白的運動、位置以及相互作用。瑞典皇家科學(xué)院在新聞公報中說，綠色熒光蛋白“已經(jīng)成為現(xiàn)代生物科學(xué)研究領(lǐng)域最重要的工具之一”。GFP之美麗和妙用GFP及其衍生物（各種熒光蛋白），絢麗多彩，非常漂亮。GFP作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽Marti

5、n Chalfie證明了GFP作為多種生物學(xué)現(xiàn)象的發(fā)光遺傳標(biāo)記的價值。在最初的一項實驗中，他用GFP使秀麗隱桿線蟲的6個單獨細(xì)胞有了顏色。馬丁沙爾菲，1947年出生，1977年獲得美國哈佛大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)博士學(xué)位，1982年起任美國哥倫比亞大學(xué)生物學(xué)教授。他獲獎的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用，這一技術(shù)被廣泛運用于生理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。諾貝爾獎評審委員會說，這種蛋白已經(jīng)成為同時代生物科學(xué)研究最重要的工具之一。Martin Chalfie2008年諾貝爾化學(xué)獎揭曉錢永健的主要貢獻(xiàn)在于讓人們理解了GFP發(fā)出熒光的機制。同時，他拓展出綠色之外的可用于標(biāo)記的其他顏色，從而使科

6、學(xué)家能夠?qū)Ω鞣N蛋白和細(xì)胞施以不同的色彩。這一切，令在同一時間跟蹤多個不同的生物學(xué)過程成為現(xiàn)實。錢永健1952年出生于美國紐約，1977年獲得英國劍橋大學(xué)生理學(xué)博士學(xué)位，1989年起任美國加州大學(xué)圣地亞哥分校生物化學(xué)及化學(xué)系教授、美國國家科學(xué)院院士、國家醫(yī)學(xué)院院士，2004年沃爾夫獎醫(yī)學(xué)獎得主。錢永健的主要貢獻(xiàn)在于利用水母發(fā)出綠光的化學(xué)物來追查實驗室內(nèi)進(jìn)行的生物反應(yīng)，他被認(rèn)為是這方面的公認(rèn)先驅(qū)。RogerY.Tsien錢永健的貢獻(xiàn)錢永健是取得重要成就的科學(xué)家。他在成像技術(shù)中，有兩項重要工作都與下村修有一定關(guān)系。一項是鈣染料。1980年錢永健發(fā)明檢測鈣離子濃度的染料分子，1981年改進(jìn)將染料引入細(xì)

7、胞的方法，以后發(fā)明更多、更好的染料，被廣泛應(yīng)用。檢測鈣的方法有三種：選擇性電極、水母素、鈣染料。在錢永健的鈣染料沒有出現(xiàn)以前，具有空間檢測能力的只有水母素，但當(dāng)時水母素需要注射到細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)用不方便，而錢永健的染料可以通透到細(xì)胞里面去。水母素和鈣染料各有優(yōu)缺點，目前用染料的人多。錢永健還發(fā)明了多種染料用于研究其他分子。錢永健的第二項工作是GFP。1994年起，錢永健開始研究GFP，改進(jìn)GFP的發(fā)光強度，發(fā)光顏色（發(fā)明變種，多種不同顏色），發(fā)明更多應(yīng)用方法，闡明發(fā)光原理。世界上應(yīng)用的FP，多半是他發(fā)明的變種。他的專利有很多人用，有公司銷售。錢永健的工作，從八十年代一開始就引人矚目。他可能是世界上被

8、邀請給學(xué)術(shù)報告最多的科學(xué)家，因為化學(xué)和生物界都愛聽他的報告，既有技術(shù)應(yīng)用、也有一些很有趣的現(xiàn)象。他1952年出生，年齡允許他等些年（而下村修沒有這個優(yōu)勢）。所以，很多人多年認(rèn)為錢永健會得諾貝爾獎，可以是化學(xué)、也可以是生理獎。值得指出，錢永健非?？隙ㄏ麓逍薜墓ぷ?，錢較早公開介紹下村修的發(fā)現(xiàn)。錢永健的貢獻(xiàn)A guide to choosing fluorescent proteins錢永健錢永健是錢學(xué)森的堂侄。他家多科學(xué)家和工程師。他中學(xué)時獲得過西屋天才獎第一名，大學(xué)在哈佛念化學(xué)和物理，20歲畢業(yè)，后獲英國劍橋大學(xué)生理學(xué)博士。他哥哥錢永佑（Richard W Tsien）是神經(jīng)生物學(xué)家，曾任Sta

9、nford大學(xué)生理系主任。兩兄弟分別獲Rhodes和Marshall學(xué)者獎（通常認(rèn)為是美國大學(xué)生競爭性最強的兩個獎學(xué)金，克林頓總統(tǒng)曾獲Rhodes），到英國留學(xué)，九十年代雙雙成為美國科學(xué)院院士。綠色熒光蛋白的優(yōu)缺點GFP操作簡單，不需要任何外加底物或輔酶因子，表達(dá)幾乎不受種屬的限制，易于得到性質(zhì)不同的突變體。特異性高、熒光穩(wěn)定、無毒害。GFP體積較大（由238個氨基酸組成），它在活體標(biāo)記中可能會影響被標(biāo)記的蛋白質(zhì)或細(xì)胞的正常生理功能。中等光穩(wěn)定性限制了它在單分子研究中的應(yīng)用。二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸抗體的熒光標(biāo)記Fluorophores and their amine-reactive derivat

10、ives異硫氰酸類Although the thiourea product is reasonably stable, it has been reported that antibody conjugated with fluorescent isothiocyanates deteriorate over time.琥珀酰亞胺酯Succinimidyl Esters are excellent reagents for amine modification because the amide bonds they form are as stable as peptide bonds.蛋

11、白的熒光標(biāo)記Thiol reactive probesThiol-reactive dyes are principally used to prepare fluorescent peptides, proteins and oligonucleotides for probing biological structure, function and interactions. Because the thiol functional group is not very common in most proteins and can be labeled with high selectiv

12、ity, thiol-reactive reagents often provide a means of modifying a protein at a defined site. 特異性的小分子蛋白熒光探針陳磊、姚祝軍，生命科學(xué)， 20，313 （2008）. 配體接受體兩部分組成：有機小分子熒光團和對目標(biāo)蛋白具有特別專一性識別作用的特定配體或是化學(xué)官能團。原理：通過基因工程的手段對目標(biāo)蛋白進(jìn)行簡潔的修飾，融入一個能與熒光探針上的配體或是官能團發(fā)生專一高效作用（成健相互作用或是非成健相互作用）的接受體， 通過兩者的相互作用實現(xiàn)蛋白的定點熒光標(biāo)記。正交有機化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用

13、雙砷染料四半胱氨酸標(biāo)簽體系 Staudinger-Bertozzi反應(yīng) Huisgen成環(huán)反應(yīng)Click反應(yīng) 天然化學(xué)鏈接反應(yīng) Diels-Alder反應(yīng)陳磊、姚祝軍，生命科學(xué)， 20，313 （2008）. 雙砷染料四半胱氨酸標(biāo)簽體系Science, 1998, 281, 269-272.As 雙砷染料四半胱氨酸標(biāo)簽體系A(chǔ)dams SR，Tsien RY，Nature protocols, 3，1527-1533 (2008).雙砷染料-四半胱氨酸體系的優(yōu)點Small size of the TC-Tag (6 amino acids, 585 Da) is less likely to i

14、nterfere with the structure or biological activity of the protein of interest. (蛋白質(zhì)的N-端和C-端，內(nèi)環(huán)或是a-螺旋的外表面）FlAsH-EDT2 and ReAsH-EDT2 labeling reagents are membrane-permeable and readily cross the cell membrane, allowing labeling and detection of recombinant proteins in live mammalian cells.FlAsH-EDT2

15、and ReAsH-EDT2 labeling reagents bind the TC-Tag with high specificity and high affinity (nM or lower KD), allowing targeted labeling of the protein of interest.雙砷染料-四半胱氨酸體系的優(yōu)點FlAsH-EDT2 and ReAsH-EDT2 labeling reagents become strongly fluorescent (green and red, respectively) only upon binding the

16、TC-Tag. They can be applied sequentially on the same sample, allowing temporal detection of protein turnover and trafficking.ReAsH-EDT2 labeling reagent can be used for both fluorescence-based microscopy and electron microscopy.FlAsH-EDT2 labeling reagent provides a superior alternative to yellow-fl

17、uorescent protein (YFP) when coupled with cyan-fluorescent protein (CFP) for FRET-based cellular analysis. The importance of pathogen detectionIdentification and quantification of infectious disease agents are important for medical diagnosis, public health, food safety, environment monitoring, and a

18、nti-bioterrorism. Speed SensitivitySpecificityBacteriophage (噬菌體) : bacterias virus Integration of biarsenical-tetracysteine and phage for bacterial detectionLN Wu, TT Huang, LL Yang, JB Pan, SB Zhu and XM Yan*, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2011, 50, 5873-5877. Bacterial detection with the TC-phage-F

19、lAsH strategy using M13-TC LN Wu, TT Huang, LL Yang, JB Pan, SB Zhu and XM Yan*, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2011, 50, 5873-5877. Bacterial detection with the TC-phage-FlAsH strategy using T7-TC LN Wu, TT Huang, LL Yang, JB Pan, SB Zhu and XM Yan*, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2011, 50, 5873-5877. LN

20、 Wu, XM Yan*, et al. Anal. Chem., 2014, 86, 907912.Trace Detection of Specific Viable Bacteria Using Tetracysteine-Tagged BacteriophagesViable target cells 1:99 1:9,900 1:2,500,000 1: 25,000,000 0 Viable target vs dead & viable but nontarget Detection limit: 1 cell/mL 正交有機化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用 雙砷染料四半胱氨酸標(biāo)

21、簽體系 Staudinger-Bertozzi反應(yīng) Huisgen成環(huán)反應(yīng)Click反應(yīng) 天然化學(xué)鏈接反應(yīng) Diels-Alder反應(yīng)陳磊、姚祝軍，生命科學(xué)， 20，313 （2008）. Staudinger-Bertozzi反應(yīng)Classical Staudinger reaction化學(xué)專一、產(chǎn)率高、與水相容、細(xì)胞環(huán)境友好Saxon E, Bertozzi CR. Science, 287, 2007-2010 (2000).Modified Staudinger reaction疊氮化物和膦生成氮葉立德氮葉立德在水的存在下自發(fā)生成一個胺和一個膦氧化物對反應(yīng)給予一定的修飾，使之成為一個酰

22、胺鍵而不是產(chǎn)生胺。將Jurkat細(xì)胞放在含疊氮乙酰甘露糖胺的培養(yǎng)液中生長，疊氮基團可以通過唾液酸生物合成途徑引入到細(xì)胞表面的糖蛋白上。此細(xì)胞和生物素化的膦作用，細(xì)胞上的疊氮基和膦反應(yīng)生成一個穩(wěn)定的肽鍵，從而形成一個非天然的生物素化的細(xì)胞表面，加入連有抗生物素的熒光探針，就實現(xiàn)了細(xì)胞表面的熒光標(biāo)記。Saxon E, Bertozzi CR. Science, 287, 2007-2010 (2000).The delivery of azides to cell surfaces through other carbohydrate biosynthetic pathways could sig

23、nificantly expand applications of cell surface engineering. Azides and phosphines are abiotic structures both inside and outside cells, which raises the exciting possibility that their ligation could proceed in the intracellular environment.Given existing powerful methods for incorporating unnatural

24、 building blocks into other biopolymers, one need not be restricted to cell surface oligosaccharides as hosts for these chemical handles. Azidoamino acids, for example, could be introduced into proteins and later targeted with phosphine probes. Saxon E, Bertozzi CR. Science, 287, 2007-2010 (2000).Di

25、stinguished Professor of Chemistry Professor of Molecular and Cell Biology at UC Berkeley. B.S. Chemistry, Harvard University,1988 Ph.D. Chemistry, UC Berkeley, 1993 Postdoc Cellular immunology, UCSF, 1993-1996 Faculty, UC Berkeley, 1996 Elected member of the American Academy of Arts and Sciences, 2

26、003 Elected member of the National Academy of Sciences, 2005 Prof. Bertozzis research interests span the disciplines of chemistry and biology with an emphasis on studies of cell surface glycosylation pertinent to disease states. Her lab focuses on profiling changes in cell surface glycosylation asso

27、ciated with cancer, inflammation and bacterial infection, and exploiting this information for development of diagnostic and therapeutic approaches. In addition, her group develops nanoscience-based technologies for probing cell function and for medical diagnostics.Carolyn R. BertozziCarolyns father,

28、 William Bertozzi (MIT Physics), and her sister, Andrea Bertozzi (UCLA Mathematics)./crbgrp/publications.htm2012正交有機化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用 雙砷染料四半胱氨酸標(biāo)簽體系 Staudinger-Bertozzi反應(yīng) Huisgen成環(huán)反應(yīng)Click反應(yīng) 天然化學(xué)鏈接反應(yīng) Diels-Alder反應(yīng)陳磊、姚祝軍，生命科學(xué)， 20，313 （2008）. Huisgen成環(huán)反應(yīng)click反應(yīng)在Cu(I)的催化下，末端炔和疊氮化物生成1,2,3三唑。高選擇性、水兼容性和高產(chǎn)率 點

29、擊化學(xué)Click chemistry，常譯成“點擊化學(xué)”，是2001年諾貝爾化學(xué)獎獲得者美國化學(xué)家Sharpless提出的一種快速合成大量化合物的新方法，是繼組合化學(xué)之后又一給傳統(tǒng)有機合成化學(xué)帶來重大革新的合成技術(shù)。目前，該技術(shù)已滲透到先導(dǎo)化合物庫的建立、新藥開發(fā)和聚合物的合成等領(lǐng)域。Dr. Barry SharplessThe Scripps Research InstituteH. C. Kolb, M. G. Finn, and K. B. Sharpless. Click chemistry: diverse chemical function from a few good reac

30、tions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40:20042021 (2001).Sharpless最廣為人知的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)并命名三種轉(zhuǎn)化過程，即不對稱催化環(huán)氧化、二羥基化反應(yīng)和不對稱氨羥化反應(yīng)。在2001年，夏普萊斯因此獲得諾貝爾化學(xué)獎。2012: 16262013: 18781 can be metabolically incorporated into outer membrane protein C (OmpC)三唑基，三氮（雜）茂基正交有機化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用 雙砷染料四半胱氨酸標(biāo)簽體系 Staudinger-Bertozzi反應(yīng) Huisgen成

31、環(huán)反應(yīng)Click反應(yīng) 天然化學(xué)鏈接反應(yīng) Diels-Alder反應(yīng)陳磊、姚祝軍，生命科學(xué)， 20，313 （2008）. Chem. Commun. 2003, 23, 2870-1.將含有半胱氨酸氮端的目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中表達(dá)，與含有硫酯的小分子熒光探針發(fā)生天然鏈接反應(yīng)，從而得到所需的熒光標(biāo)記蛋白。只有很少一些內(nèi)源性的含N- 端半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)存在于各種各樣細(xì)菌和哺乳動物的基因庫中，使得基于天然鏈接反應(yīng)的標(biāo)記方法可在不同的活細(xì)胞成像實驗中得到應(yīng)用。正交有機化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用 雙砷染料四半胱氨酸標(biāo)簽體系 Staudinger-Bertozzi反應(yīng) Huisgen成環(huán)反應(yīng)Clic

32、k反應(yīng) 天然化學(xué)鏈接反應(yīng) Diels-Alder反應(yīng)陳磊、姚祝軍，生命科學(xué)， 20，313 （2008）. Chem. Eur. J. 2006,12, 6095-6109.雙烯加成，由共軛雙烯與烯烴或炔烴反應(yīng)生成六元環(huán)的反應(yīng) 酶參與的細(xì)胞反應(yīng)在蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用 AGT和受體組合熒光探針 脫鹵酶和受體組合熒光探針 PPtase和受體(PCP、ACP)組合熒光探針 生物素連接酶和受體組合熒光探針 轉(zhuǎn)谷氨酰(TGase)和受體組合熒光探針 蛋白蛋白相互作用用于蛋白熒光標(biāo)記陳磊、姚祝軍，生命科學(xué)， 20，313 （2008）. Nat Biotechnol, 2003, 21, 86-89.AGT和受體組合熒光探針將hAGT蛋白融合到目標(biāo)蛋白上，然后利用hAGT蛋白本身的活性將DNA上的氧上被烷基化的鳥磦呤的烷基轉(zhuǎn)移到它本身的半胱氨酸的硫原子上，在硫原子上進(jìn)行細(xì)胞友好的烷基化反應(yīng)，將標(biāo)簽分子連接到目標(biāo)融合蛋白上。DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT) 人體DNA修復(fù)蛋白（hAGT, 25000 Da）Accounts Chem. Res. 2011, 44, 666-676.Accounts Chem. Res. 2011, 44, 730-741.Accounts Chem. Res. 2011, 44, 730-741.Accounts Chem. Res. 2011, 44