酶的生物合成法生產(chǎn)市公開(kāi)課獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、第三章 酶生物合成與發(fā)酵生產(chǎn) 第1頁(yè)第1頁(yè)酶生產(chǎn)辦法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(chemicalsynthesis)SOD - bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from AspergillusPlant cell cultureAnimal cell cultureFew example第2頁(yè)第2頁(yè) 第一

2、節(jié) 酶生物合成及調(diào)整一、酶生物合成 遺傳信息傳遞中心法則轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA 蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA 第3頁(yè)第3頁(yè)（一）RNA生物合成-轉(zhuǎn)錄(transcription) 定義 以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）作用下，生成RNA分子過(guò)程。.第4頁(yè)第4頁(yè)轉(zhuǎn)錄模板 啟動(dòng)子（promotor) 終止子(terminator)模板鏈（template strand）反意義鏈(antisense strand)編碼鏈 (coding strand)故意義鏈(sense strand)DNA5533反意義鏈:指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用一條DNA鏈故意義鏈:無(wú)轉(zhuǎn)錄功效

3、一條DNA鏈.第5頁(yè)第5頁(yè)T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶故意義鏈反意義鏈RNAPPi553GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上生物合成335第6頁(yè)第6頁(yè)RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程(三步)1.起始2.延長(zhǎng)3.終止 第7頁(yè)第7頁(yè) 原核生物RNA聚合酶(DDRP)E. coliRNA聚合酶是由四種亞基構(gòu)成五聚體（ 2 ）起始因子第8頁(yè)第8頁(yè)RNA合成過(guò)程起始雙鏈DNA局部解開(kāi)磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長(zhǎng)階段53RNA 啟動(dòng)子（promotor) 終止子(terminator)5RNA聚合酶535355

4、3離開(kāi)第9頁(yè)第9頁(yè)RNA鏈延伸圖解35RNA-DNA雜交螺旋聚合酶移動(dòng)方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長(zhǎng)部位第10頁(yè)第10頁(yè) 定義 以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過(guò)各種tRNA、酶和輔助因子作用，合成多肽鏈過(guò)程。（二）蛋白質(zhì)生物合成-翻譯(translation) 第11頁(yè)第11頁(yè)酪553AUGGUU UAC ACA酪氨酰- tRNA反密碼mRNA密碼與反密碼堿基配對(duì)第12頁(yè)第12頁(yè)AUG ACA5蛋蘇UGUGUU3受 位(A位)給 位(P位)大亞基小亞基第13頁(yè)第13頁(yè) 蛋白質(zhì)合成過(guò)程 （大腸桿菌） 氨基酸活化 肽鏈合成起始 肽鏈延伸 肽鏈合成終止與釋放第14頁(yè)

5、第14頁(yè)氨基酸活化與轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)式：AA + tRNA + ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi 對(duì)于E.coli而言，肽鏈合成時(shí)第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。第15頁(yè)第15頁(yè)在核糖體上合成多肽（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段第16頁(yè)第16頁(yè)肽鏈合成起始階段1.mRNA與小亞基結(jié)合：形成30S-mRNA-IF3復(fù)合物2.AUG與蛋氨酰-tRNA結(jié)合： 30S-mRNA-IF3 fMet-tRNA-IF2-GTP fMet-tRNA正好位于mRNA起始密碼子上（AUG）。3.大小亞基結(jié)合IF130S起始復(fù)合物第17頁(yè)第17頁(yè)AUG ACA53AUG AC

6、A53UACUACAUG ACA53小亞基mRNA蛋氨酰tRNA GTP大亞基GDP+Pi受位給位蛋蛋肽鏈合成起始階段第18頁(yè)第18頁(yè)肽鏈合成延伸階段1.進(jìn)位:氨基酰-tRNA進(jìn)入受位;2.轉(zhuǎn)肽:形成肽鍵,在轉(zhuǎn)肽酶作用下,給位與 受位結(jié)合;3.移位:核蛋白體向3端移動(dòng)一個(gè)密碼子 位置,空出受位,不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、 移位,使肽鏈延長(zhǎng)。第19頁(yè)第19頁(yè)AUG ACA53UAC蛋蘇UGUAUG ACA5UAC蛋蘇UGUGUUAUG ACA5UAC蛋蘇UGUGUUAUG ACA5蛋蘇UGUGUU333GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始復(fù)合體進(jìn)位轉(zhuǎn)肽移位Mg+K+第20頁(yè)第20頁(yè)肽鏈合成終止階段

7、1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合;2.肽鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離. 第21頁(yè)第21頁(yè)AUG UAA5UACAUG UAA5UAC33終終AUG UAA5UAC3終53UAC終肽鏈第22頁(yè)第22頁(yè)第23頁(yè)第23頁(yè)二、酶生物合成調(diào)整定義：通過(guò)調(diào)整酶合成量來(lái)控制微生物代謝速度調(diào)整機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。意義：通過(guò)制止酶過(guò)量合成，節(jié)約生物合成原料和能量。第24頁(yè)第24頁(yè) 操縱子基因表示協(xié)同單位操縱子結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì), structural gene, S）控制部位操縱基因（operator gene, O）啟動(dòng)子（promotor gene, P）（一）基因調(diào)控

8、理論 Jacob and Monod操縱子學(xué)說(shuō)（operon theory） 第25頁(yè)第25頁(yè)結(jié)構(gòu)基因（Structural gene）: 決定某一多肽DNA模板，與酶有各自相應(yīng)關(guān)系，其中遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。第26頁(yè)第26頁(yè) cAMP-CRP復(fù)合物作用示意圖 啟動(dòng)基因（promotor gene）（啟動(dòng)子）： 有兩個(gè)位點(diǎn)： （1）RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（2）cAMP-CAP結(jié)合位點(diǎn)。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又稱(chēng)環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP

9、-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子位點(diǎn)上，RNA聚合酶才干結(jié)合到其在啟動(dòng)子位點(diǎn)上，酶合成才干開(kāi)始。 第27頁(yè)第27頁(yè)操縱基因（Operater gene）: 位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間一段堿基順序，能特異性地與調(diào)整基因產(chǎn)生變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成時(shí)機(jī)與速度。第28頁(yè)第28頁(yè) 調(diào)整基因(regulator gene)： 可產(chǎn)生一個(gè)構(gòu)成型調(diào)整蛋白(regulatory protein) （一個(gè)變構(gòu)蛋白），通過(guò)與效應(yīng)物(effector) （包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因結(jié)合力。 調(diào)整基因常位于調(diào)控區(qū)上游。第29頁(yè)第29頁(yè)基因操縱子調(diào)整系統(tǒng)示意圖 調(diào)整基因 啟動(dòng)基因 操縱

10、基因 結(jié)構(gòu)基因 DNA 轉(zhuǎn)錄 （-） RNA聚合酶 （+） 轉(zhuǎn)錄 翻譯 mRNA 翻譯 調(diào)整蛋白 蛋白質(zhì) 效應(yīng)物控制區(qū) 信息區(qū)操縱子第30頁(yè)第30頁(yè)(二) 酶合成調(diào)整類(lèi)型 1.誘導(dǎo) (induction) 構(gòu)成酶：細(xì)胞固有酶類(lèi)。 誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來(lái)底物或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似 物而暫時(shí)合成一類(lèi)酶。 2.阻遏 (repression) 分解代謝物阻遏(catabolite repression) 反饋?zhàn)瓒?feedback repression)第31頁(yè)第31頁(yè)（三）酶合成調(diào)整機(jī)制 1. 酶合成誘導(dǎo)加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行。 酶合成誘導(dǎo)現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖酶有： -半乳糖苷酶； -

11、半乳糖苷透過(guò)酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。試驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長(zhǎng)在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成。第32頁(yè)第32頁(yè)調(diào)整基因操縱基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏物(調(diào)整蛋白)（有活性）基 因 關(guān) 閉啟動(dòng)子ORPLacZLacYLaca調(diào)整基因操縱基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏物 （無(wú)活性） 基 因 表示mRNAA、乳糖操縱子結(jié)構(gòu)B、乳糖酶誘導(dǎo) 乳糖(效應(yīng)物)阻遏物 （有活性）誘導(dǎo)第33頁(yè)第33頁(yè) 2.反饋（末端產(chǎn)物）阻遏

12、由某代謝路徑末端產(chǎn)物過(guò)量累積引起阻遏。 酶合成阻遏現(xiàn)象： 試驗(yàn)： （1）大腸桿菌生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)， 檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶存在； （2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)覺(jué)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶活性減少，直至消失。 （3）表明色氨酸存在制止了色氨酸合成酶合成，表達(dá)了菌體生長(zhǎng)經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成。第34頁(yè)第34頁(yè) 色氨酸操縱子酶阻遏調(diào)整基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表示調(diào)整基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生改變與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表示調(diào)整蛋白第35頁(yè)第35頁(yè)酶誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏物加誘導(dǎo)劑

13、A.有活性阻遏物C.無(wú)活性阻遏蛋白D.無(wú)活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動(dòng)基因調(diào)整基因結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表示誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因作用,結(jié)構(gòu)基因能夠表示酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合, 結(jié)構(gòu)基因能夠表示阻遏蛋白(無(wú)活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表示代謝產(chǎn)物第36頁(yè)第36頁(yè)調(diào)控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶誘導(dǎo)有活性不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶阻遏無(wú)活性阻遏物不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控

14、作用對(duì)比第37頁(yè)第37頁(yè)3.分解代謝物阻遏指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快那種分解底物會(huì)阻遏利用慢底物相關(guān)酶合成現(xiàn)象。分解代謝物阻遏作用，并非由于快速利用甲碳源本身直接作用結(jié)果，而是通過(guò)甲碳源（或氮源等）在其分解過(guò)程中所產(chǎn)生中間代謝物所引起阻遏作用。第38頁(yè)第38頁(yè)分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 試驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開(kāi)始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開(kāi)一個(gè)生長(zhǎng)延滯期“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象”(diauxie或biphasic growth）。 這一現(xiàn)象又稱(chēng)葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系合成。此調(diào)整基因產(chǎn)物是

15、環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱(chēng)降解物基因活化蛋白（CAP）。第39頁(yè)第39頁(yè)分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基 因 表示CRP基因結(jié)構(gòu)基因TCRPOCAP結(jié)合部位 RNA聚合酶TcAMP -CRPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5-AMP克制激活葡萄糖降解物與cAMP關(guān)系cAMPCRP：環(huán)腺苷酸受體蛋白或降解物(分解代謝產(chǎn)物)基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）減少cAMP濃度使CRP呈失活狀態(tài)第40頁(yè)第40頁(yè)三、提升酶產(chǎn)量策略（一）菌種選育（一勞永逸） 1.誘變育種 (1)

16、使誘導(dǎo)型變?yōu)闃?gòu)成型選育構(gòu)成型突變株(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?選育營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型突變株解除反饋?zhàn)瓒?選育結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種 第41頁(yè)第41頁(yè)（二）條件控制1. 添加誘導(dǎo)物 酶底物類(lèi)似物最有效。2. 減少阻遏物濃度 除去終產(chǎn)物產(chǎn)物阻遏 添加制止產(chǎn)物形成克制劑 避免使用葡萄糖分解代謝物阻遏 避免培養(yǎng)基過(guò)于豐富 添加一定量cAMP第42頁(yè)第42頁(yè)3.添加表面活性劑 離子型 對(duì)細(xì)胞有毒害作用表面活性劑 Tween80 非離子型 增長(zhǎng)細(xì)胞通透性 TritonX1004. 添加產(chǎn)酶增進(jìn)劑第43頁(yè)第43頁(yè) 第二節(jié) 酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué) 一、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

17、在分批培養(yǎng)(batch culture)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)普通要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期和衰亡期5個(gè)階段。第44頁(yè)第44頁(yè) 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 O-A 延遲期 A-B指數(shù)生長(zhǎng)期 B-C減速期 C-D 靜止期 D-E 衰亡期 第45頁(yè)第45頁(yè) 營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）和生長(zhǎng)速率之間動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型:比生長(zhǎng)速率（1/h） （specific growth rate）max：最大比生長(zhǎng)速率（1/h）S：營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度） 克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù) 克/L，或 mol/L第46頁(yè)第46頁(yè) 二、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) （一） 酶生物合成模式 依據(jù)酶合成與細(xì)胞

18、生長(zhǎng)之間關(guān)系，可將酶生物合成份為3種模式，即： 同時(shí)合成型 生長(zhǎng)偶聯(lián)型 中期合成型 部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型延續(xù)合成型 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 滯后合成型第47頁(yè)第47頁(yè)1. 生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱(chēng)同時(shí)合成型） 酶生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)。特點(diǎn)：酶合成能夠誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。 當(dāng)清除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶合成馬上停止，表明這類(lèi)酶所相應(yīng)mRNA很不穩(wěn)定。第48頁(yè)第48頁(yè)生長(zhǎng)偶聯(lián)型中特殊形式中期合成型 酶合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開(kāi)始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶合成也伴隨停止。特點(diǎn)：酶合成受產(chǎn)物反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。 所相應(yīng)mRNA是不穩(wěn)定。 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線 第49頁(yè)第49頁(yè)2

19、.部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱(chēng)延續(xù)合成型） 酶合成在細(xì)胞生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還能夠延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，普通不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。 所相應(yīng)mRNA相稱(chēng)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線第50頁(yè)第50頁(yè)3. 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱(chēng)滯后合成型） 只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開(kāi)始合成并大量積累。許多水解酶生物合成都屬于這一類(lèi)型。特點(diǎn)：受分解代謝物阻遏作用。 所相應(yīng)mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 第51頁(yè)第51頁(yè)總結(jié)：影響酶生物合成模式主要原因 高：可在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼 1）mRNA穩(wěn)定性 續(xù)合成酶 差：伴隨細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終 止酶合成 2）培養(yǎng)基中阻遏物存

20、在 不受阻遏：伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)而開(kāi)始酶合成。 受阻遏：細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或平衡期后，酶才開(kāi)始 合成。第52頁(yè)第52頁(yè) 酶生產(chǎn)中最抱負(fù)合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有生長(zhǎng)久和產(chǎn)酶期顯著差異。細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)就有酶產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還能夠繼續(xù)生成一段時(shí)間。 對(duì)于：同時(shí)合成型：提升對(duì)應(yīng)mRNA穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵 溫度 。滯后合成型：盡也許降低甚至解除分解代謝物阻遏，使 酶合成提早開(kāi)始。中期合成型：要在提升mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方 面努力。第53頁(yè)第53頁(yè)(二) 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)普通產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表示為：式中 X細(xì)胞濃度(g /L) 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1) 生長(zhǎng)偶聯(lián)比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g)

21、 非生長(zhǎng)偶聯(lián)比產(chǎn)酶速率(IU/(gh) E酶濃度(IU/L) t時(shí)間(h)第54頁(yè)第54頁(yè)生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 第55頁(yè)第55頁(yè) 第三節(jié) 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶 一、產(chǎn)酶微生物分離和選育 1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備條件 （1）酶產(chǎn)量高 （2）易培養(yǎng)（生長(zhǎng)速率高、營(yíng)養(yǎng)要求低） （3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化 （4）易分離提純 （5）安全可靠（不是致病菌）第56頁(yè)第56頁(yè)2.慣用產(chǎn)酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAs

22、pergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida第57頁(yè)第57頁(yè) 3. 產(chǎn)酶微生物分離和篩選 1)樣品采集:從富含該酶作用底物場(chǎng)合采集樣品 2)富集培養(yǎng): 投其所好，取其所抗 3)分離取得微生物純培養(yǎng)（pure culture）。 4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。 5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對(duì)較高菌株，以質(zhì)為主。 第58頁(yè)第58頁(yè) -淀粉酶篩選第59頁(yè)第59頁(yè)蛋白酶產(chǎn)生菌取得辦法應(yīng)用含酪蛋白培養(yǎng)基第60頁(yè)第60頁(yè)4.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種選育

23、誘變育種 原生質(zhì)體融合育種 基因工程育種 第61頁(yè)第61頁(yè) 二.微生物發(fā)酵產(chǎn)酶辦法 1.固體培養(yǎng):尤其適合于霉菌培養(yǎng) 2.液體培養(yǎng):當(dāng)前酶發(fā)酵生產(chǎn)主要方式 3.固定化細(xì)胞 :需要特殊固定化細(xì)胞反應(yīng)器 第62頁(yè)第62頁(yè)三.微生物酶類(lèi)型 1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中大分子而釋放到細(xì)胞外，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到調(diào)整控制少。 2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物調(diào)控。第63頁(yè)第63頁(yè)酶發(fā)酵生產(chǎn)普通工藝流程 第64頁(yè)第64頁(yè)第四節(jié) 動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞和植

24、物細(xì)胞含有各自不同特性，需采取各自不同培養(yǎng)工藝。 第65頁(yè)第65頁(yè)動(dòng)物細(xì)胞模式圖第66頁(yè)第66頁(yè)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)第67頁(yè)第67頁(yè) 植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞特性比較細(xì)胞種類(lèi)植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um20030011010100倍增時(shí)間/h120.3-615營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)樸簡(jiǎn)樸復(fù)雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等第68頁(yè)第68頁(yè)三者之間差別主要有：植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)樸。植物細(xì)胞生長(zhǎng)以及次級(jí)

25、代謝物生產(chǎn)要求一定光照。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞主要目的產(chǎn)物各不相同。第69頁(yè)第69頁(yè)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1.植物細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn) 2.培養(yǎng)基特點(diǎn) 應(yīng)用最廣是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基 MS培養(yǎng)基是1962年由Murashinge和Skoog為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)培養(yǎng)基。LS培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而來(lái)。第70頁(yè)第70頁(yè)3.培養(yǎng)辦法：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞株建立；外植體與愈傷組織擴(kuò)大培養(yǎng)；大罐培養(yǎng)；第71頁(yè)第71頁(yè)外植體： 從植株取出，通過(guò)預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等）片段或小塊。愈傷組織： 將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于25左右培養(yǎng)一段時(shí)間，從外植體切口部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。第72頁(yè)第72頁(yè)水稻外植體（幼胚）和愈傷組織外植體愈傷組織第73頁(yè)第73頁(yè)4. 培養(yǎng)條件影響與控制（1）溫度（2）pH（3）通氣與攪拌（4）光照控制（5）前體添加（飼喂）（6）誘導(dǎo)子（elicitors）應(yīng)用第74頁(yè)第74頁(yè)5.植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實(shí)例 以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例(1)大蒜愈傷組織誘導(dǎo) 選取堅(jiān)固、飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害大蒜蒜瓣，清除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后