大學(xué)微生物遺傳與育種實驗2015

1、微生物遺傳與育種實驗 師 亮生科樓C5014Tell:84395602Email：教學(xué)目的掌握微生物遺傳與育種的相關(guān)研究技術(shù)：誘變、雜交、轉(zhuǎn)化、性狀檢測、遺傳分析等將遺傳學(xué)知識與育種技術(shù)相結(jié)合，達(dá)到具備獨立進(jìn)行遺傳學(xué)實驗設(shè)計、微生物育種技術(shù)路線設(shè)計與現(xiàn)代微生物分子遺傳技術(shù)操作能力的目標(biāo)。實驗假說多糖：是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過10個的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。纖維素、幾丁質(zhì)：可構(gòu)成植物或動物骨架淀粉、糖原：可作為生物體儲存能量的物質(zhì)生物活性：免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗癌、降血糖酵母多糖優(yōu)質(zhì)免疫多糖、優(yōu)質(zhì)功能膳食纖維根瘤菌多糖根瘤菌能產(chǎn)生胞外多糖(EPS)、莢膜多糖(KPS)、脂多糖(L

2、PS)和環(huán)狀葡聚糖四種多糖類物質(zhì)。根瘤菌的EPS能夠富集環(huán)境中營養(yǎng)元素的功能，另外，對于共生固氮過程具有重要作用基因突變及其機制突變自發(fā)突變誘發(fā)突變 環(huán)境因素的影響，DNA復(fù)制過程的偶然錯誤等而導(dǎo)致，一般頻率較低，通常為10-6-10-9 。 某些物理、化學(xué)因素對生物體的DNA進(jìn)行直接作用，突變以較高的頻率產(chǎn)生。 轉(zhuǎn)座子常用的一種誘變因子，它們在基因組的任何部位插入，一旦插入某基因的編碼序列，就引起該基因的失活而導(dǎo)致中斷突變， 由于轉(zhuǎn)座因子Tn5帶有可選擇標(biāo)記(抗生素抗性)，因此可容易地分離到所需的突變基因。實驗內(nèi)容多糖產(chǎn)生菌突變株的篩選和鑒定根瘤菌多糖產(chǎn)量測定 根瘤菌抗生素抗性檢測兩親本雜交

3、 雜交子篩選和鑒定 材料菌種：根瘤菌W33、E.coli （ pSC123, miniTn5，Knr）抗生素：卡那霉素，四環(huán)素，利福霉素，95%酒精培養(yǎng)基：（1）TY培養(yǎng)基（培養(yǎng)根瘤菌（2）蔗糖酵母膏培養(yǎng)基（篩選根瘤菌）（3）LB培養(yǎng)基：儀器： 技術(shù)路線雜交子鑒定兩親本雜交雜交子篩選E.coli （miniTn5，Knr） 多糖含量測定出發(fā)菌株抗性測定出發(fā)菌株選擇二、實驗原理1. 培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)微生物的基質(zhì) （簡單描述）（碳源、氮源、礦物質(zhì)、生長因子、微量元素、水）培養(yǎng)基的種類：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基固體、液體、半固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基 （Synthetic

4、Dropout)2. 無菌技術(shù)：使用物理（機械）或化學(xué)的方法將微生物殺死的技術(shù)三、實驗內(nèi)容TY培養(yǎng)基（根瘤菌）LB培養(yǎng)基（大腸桿菌）甘露醇酵母膏培養(yǎng)基（根瘤菌）TY培養(yǎng)基 1. 培養(yǎng)基的配制液體固體2. 無菌水的制備實驗基本流程設(shè)計、計算、準(zhǔn)備原料稱量、溶解調(diào)節(jié)pH 分裝 （培養(yǎng)基不要碰到試管口）塞棉塞/扎口玻璃器皿的包扎滅菌 （培養(yǎng)皿、試管、移液管）滅菌試管中的固體培養(yǎng)基（擺斜面）四、實驗步驟TY培養(yǎng)基胰蛋白胨5.0 g，酵母粉3.0 g，CaCl2 0.3 g，水1000 mL，（固體培養(yǎng)基瓊脂2%），pH 7.0。1 根瘤菌抗性檢測用：1000 mL，固體（500 mL*2）2 雙親雜交

5、用：1000 mlL，固體（500 mL*2）3 生物膜用：試管3 mL*10個*15組 液體甘露醇酵母膏培養(yǎng)基甘露醇1%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉0.01%，硫酸鎂 0.02%，酵母粉0.1%，剛果紅（0.4%）10 mL，（固體培養(yǎng)基瓊脂2%），pH 7.0-7.5。4 多糖測定：100 mL/250 mL三角瓶，共4瓶。液體固體培養(yǎng)基：5、6、7200 mL/500 mL三角瓶，每組1瓶，共15+1瓶（雙抗+無抗）8500 mL/1 L三角瓶，共2+1瓶9200 mL/500 mL三角瓶，共2+1瓶10 復(fù)篩用，5 mL*（2+1）*3*15。 液體其他無菌材料11 無菌濾膜：0.2

6、2 m 濾膜：300 片；水浸濕，15 片/平板（蓋、底都放），計20個平板12 無菌牙簽：200根牙簽（50*4） 2 mL無菌離心管：50個/盒*213 無菌水：100 mL/250 mL三角瓶*10一、根瘤菌多糖產(chǎn)量測定（硫酸蒽酮法）菌液制備： 胞外多糖的提取胞外多糖的測定-蒽酮比色法發(fā)酵液取1ml上清液棄上清，取沉淀5000 rpm離心10 min加3倍體積無水乙醇，4沉淀2 h，5000 rpm離心15 min加1ml無水乙醇洗滌沉淀，重溶于去離子水，加0.5倍體積氯仿：正丁醇(5:2)，震蕩，離心，反復(fù)多次，至無白色沉淀產(chǎn)生取1 ml上層清液（多糖溶液）用于測定多糖含量胞外多糖的提

7、取管號操作空白標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度梯度樣品012345ABC葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)0.51.01.52.02.5樣品待測液(mL)0.10.10.1蒸餾水(mL)2.52.00.51.50.50.02.42.42.4蒽酮試劑(mL)各5.0反應(yīng)冰水冷卻，各管混勻，加蓋子，100保溫10 min定容冷卻；平衡10 min，分別用蒸餾水定容至25 mL比色以0號管為空白參比，測定=620 nm處的吸光度記錄吸光度（A620）胞外多糖的測定-蒽酮比色法二、根瘤菌的抗生素抗性測定實驗步驟：準(zhǔn)備抗生素藥敏片菌懸液制備 含菌平板制備 用無菌鑷子將不同濃度抗生素濾紙片貼到含菌平板上（注意一次性放入，不要移動位置。）

8、，靜置培養(yǎng)36 h后觀察濾紙片周圍菌苔生長情況，確定根瘤菌抗性和濃度。 pSC123，miniTn5，Knr轉(zhuǎn)座子KnrTraJIRIR三、兩親本雜交細(xì)菌培養(yǎng) （實驗準(zhǔn)備）：雜交（每組3個重復(fù)）:設(shè)置受體菌:供體菌的比例為1:1、1:2、2:1三種處理，分別取1份（500 l）或2份根瘤菌和E.coli菌懸液混合于小離心管中，8000 rpm離心3 min，收集菌體，用50 l無菌水重懸后吸至細(xì)菌濾膜上。 將置有濾膜的TY平板（無抗）取出，將菌懸液滴在濾膜上，30培養(yǎng)過夜后，用1 mL無菌水將菌體洗下，稀釋一定倍數(shù)后吸取0.1 mL菌液涂布于含有卡那霉素50 g/ml、氨芐青霉素100 g/m

9、l的甘露醇平板上（WT菌株做對照-無抗平板），30培養(yǎng)3 d，挑取能夠生長、菌落大小發(fā)生明顯變化的菌落轉(zhuǎn)移到甘露醇培養(yǎng)基上進(jìn)一步驗證篩選。 驗證篩選用無菌牙簽挑取能夠生長、菌落大小發(fā)生明顯變化的菌落轉(zhuǎn)移到3 ml TY液體培養(yǎng)基中（每個菌落用一只牙簽接種一只試管培養(yǎng)基），混勻，28靜置培養(yǎng)3 d，觀察生物膜形成厚薄。選取生物膜厚度顯著增加或減少的菌株轉(zhuǎn)移到含卡那霉素50 g/ml的甘露醇固體培養(yǎng)基上劃線純化。突變株產(chǎn)多糖量測定（復(fù)篩）挑取菌落變化的菌株接種到根瘤菌培養(yǎng)基中，對照接種野生型W33，每個處理重復(fù)3次，28150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，用硫酸蒽酮法測定多糖含量。比較突變株與野生

10、型菌株產(chǎn)多糖量的差異。多糖產(chǎn)量（mg/ml）平均值標(biāo)準(zhǔn)差差異分析突變株1123突變株2123突變株3123野生型W33123四、突變位點的檢測作業(yè)：設(shè)計實驗技術(shù)路線，檢測Tn5插入在染色體上還是以存在于質(zhì)粒上？時間安排時間實驗內(nèi)容備注第3周（9月17日）課程安排、實驗內(nèi)容布置第4周（9月24日）培養(yǎng)基配制等實驗準(zhǔn)備第5周（10月1日）放假第6周（10月8日）一、根瘤菌多糖產(chǎn)量測定（硫酸蒽酮法）課后觀察結(jié)果第7周（10月15日）補課二、根瘤菌的抗生素抗性測定晚上7點課后觀察結(jié)果第8周（10月22日）三、兩親本雜交（雜交試驗）課后觀察結(jié)果，挑取菌落接種第9周（10月29日）補課三、兩親本雜交（驗證篩選、復(fù)篩）晚上7點課后觀察結(jié)果，挑取菌落接種第16周（6月12日）放假分組安排培養(yǎng)基配制TY培養(yǎng)基（培養(yǎng)根瘤菌）：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉3.0 g，CaCl2 0.3 g，水1000 ml， ，（固體培養(yǎng)基瓊脂2%）， pH 7.0。雜交用，50ml液體/250ml三角瓶，每組2瓶?？剐詼y試用，250ml固體/500ml三角瓶，每組4瓶。初篩用，3ml/試管，每組30支。甘露醇酵母膏培養(yǎng)基（培養(yǎng)根瘤菌）：甘露醇1%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉0.01%，硫酸鎂 0.02%，酵母粉0.1%，剛果紅（0.4%）10 ml，（固體培養(yǎng)基瓊脂2%），pH 7.0-7.5。多糖測定用， 50