基因克隆載體 (3)講稿

1、關(guān)于基因克隆載體 (3)第一張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 病毒（噬菌體）克隆載體病毒基本結(jié)構(gòu)： DNA（或RNA）+ 外殼蛋白 噬菌體:感染細(xì)菌的病毒 分類（根據(jù)病毒與宿主的關(guān)系）溫和性病毒： 溶原性增殖構(gòu)建病毒載體 烈性病毒： 溶菌性增殖改造后 第二張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的電子顯微鏡照片一、噬菌體克隆載體第三張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA + 外殼蛋白 1、DNA (48.5kb) 噬菌體中：線性 宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn))（一） 噬菌體性質(zhì)第四張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在噬菌體內(nèi)呈線性雙鏈DNA分子(4850

2、2bp)在兩端各有12個(gè)堿基組成的5單鏈互補(bǔ)粘性末端(Cohesive end )；進(jìn)入宿主細(xì)胞后，粘性末端連接形成環(huán)狀分子(Cos位點(diǎn))。（DNA連接酶）第五張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、噬菌體基因組有基因61個(gè)以上J與N、P與Q之間為非必需序列第六張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月迄今已經(jīng)定位的噬菌體基因至少有61個(gè)，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的調(diào)控（必需基因）；另一部分基因則被稱為非必需基因；當(dāng)它們被外源基因取代后，不影響噬菌體的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重組噬菌體DNA，可以隨寄主細(xì)胞一起被復(fù)制和增殖。第七張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于20

3、22年6月3、 限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn): 56種4、 噬菌體的生長(zhǎng)途徑 溶菌生長(zhǎng)途徑 溶原生長(zhǎng)途徑宿主合成int基因產(chǎn)物-DNA整合到染色體DNA上 某種脅迫條件下合成six基因產(chǎn)物-DNA脫離細(xì)菌染色體溶菌第八張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）構(gòu)建依據(jù) 1、噬菌體是一種溫和噬菌體 2、能承載較大的外源DNA片段 野生型DNA頭部可包裝約36.451kb(自身的75%105%)，且約有20kb DNA可缺失（生長(zhǎng)非必需） 3、在DNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 第九張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 策略: 切去部分非必需區(qū)刪掉多余的限制性內(nèi)切酶

4、位點(diǎn)插入選擇性標(biāo)記基因建立體外包裝系統(tǒng)第十張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)路線 1、用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識(shí)別位點(diǎn) 選定一種酶，以gtWES 為例，EcoRI（48.5kb） DNA E co R I 6個(gè)片段 第十一張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月B片段是噬菌體生長(zhǎng)非必需的； C片段缺失可阻斷溶原生長(zhǎng)途徑，但不影響溶菌途徑； E片段去掉min5序列（2.6kb）。 兩端EcoR I別點(diǎn)經(jīng)點(diǎn)突變或甲基化處理，即得gtWES：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb）克隆能力： 替換B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最?。?6.4-(40

5、.4-4.9)=0.9kb 實(shí)際應(yīng)用時(shí)克隆能力略有出入（p109,表3-5） 4.9kb21.6kb5.5kb7.5kb5.9kb3.3kb第十二張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2、在DNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因（1）自然篩選（51kb或36.4kb不能包裝）（2）插入選擇標(biāo)記基因 取代red和gam基因野生型噬菌體(Spi+表型) 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中不能生長(zhǎng) （red、gam基因）外源DNA取代 獲Spi-表型 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中能生長(zhǎng) red、gam基因 局限性：只能以P2噬菌體溶原細(xì)胞作為受體 最常用的篩選標(biāo)記：Lac Z基因第十三張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作

6、于2022年6月3、建立重組DNA分子體外包裝系統(tǒng)體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。野生型噬菌體感染的細(xì)胞中無(wú)多余的外殼蛋白。D-（D基因缺失噬菌體）受體細(xì)胞積累除D蛋白以外所有蛋白質(zhì)E-（E基因缺失噬菌體）受體細(xì)胞積累除E蛋白以外所有蛋白質(zhì)混合 D、E互補(bǔ) 包裝DNA分子 噬菌體 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-)第十四張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（四） 噬菌體克隆載體的應(yīng)用 1、建立c DNA基因文庫(kù) 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程

7、。效率高。轉(zhuǎn)染(transfection) 指真核細(xì)胞主動(dòng)或者被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA 片段而獲得新表型的過(guò)程。2、克隆外源目的基因第十六張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（五）重組DNA分子的體外包裝（自學(xué)）1、溶原菌BHB2688(E- )和BHB2690(D-)的檢驗(yàn)2、制備包裝物3、體外包裝第十七張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）構(gòu)建策略 由質(zhì)粒和含cos位點(diǎn)的DNA片段組裝成的載體，即cosmid克隆載體,又叫粘粒; 或：cosmid克隆載體是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質(zhì)粒DNA分子。是噬菌體質(zhì)粒混合物。二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體） 第十八張，PP

8、T共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二） cosmid的特征 1、環(huán)形雙鏈DNA分子,36.4kb,一般10kb 2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制 3、含有一個(gè)cos位點(diǎn) A蛋白 cos末端體外包裝成為噬菌體，但不含噬菌體溶菌生長(zhǎng)途徑、溶原生長(zhǎng)途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體第十九張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA 若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。 因此，cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫(kù)。第二十張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于202

9、2年6月（三）柯斯克隆(Cosmid cloning) (1)定義 應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作載體，在大腸桿菌寄主細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)，叫做柯斯克隆。這個(gè)定義的三個(gè)要點(diǎn)是：a.柯斯質(zhì)粒作載體；b.大腸桿菌為寄主;c.克隆大片段的真核基因組DNA。第二十一張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）理論依據(jù)a.在phage線性DNA分子的每一端都具有彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端(cos位點(diǎn))b.phage的多連體分子是由cos連接而成的。cos cos cos cos cos cosc.末端酶(treminase)或叫Ter體系即phage具有一種位點(diǎn)特異的切割體系(si

10、te-specific cutting system).A蛋白*此系統(tǒng)能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的(36.451kb)cos位點(diǎn)，并切割之。*根據(jù)上述分析可知phage DNA包裝的兩個(gè)必要條件是：cos位點(diǎn)、Ter體系（A蛋白）第二十二張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）柯斯質(zhì)粒包裝條件 由于只有在被作用的DNA分子具有兩個(gè)cos位點(diǎn)，而且它們之間距離保持在36.451kb的條件下，Ter體系才能對(duì)它發(fā)生作用。據(jù)此推斷： 柯斯質(zhì)粒是不能作為包裝體系的，因?yàn)樗挥幸粋€(gè)cos位點(diǎn)。因此：柯斯質(zhì)粒只有在同適當(dāng)大小的外源DNA片段重組成具有兩個(gè)cos位點(diǎn)而且相距達(dá)36.451kb之間時(shí)，才能被包

11、裝。第二十三張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 利用Cos質(zhì)粒進(jìn)行克隆 第二十四張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（四）使用cosmid載體的基本程序 利用cosmid的質(zhì)粒性質(zhì)，可按質(zhì)粒操作轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 利用cosmid的噬菌體性質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞（下圖）第二十五張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、M13噬菌體克隆載體（單鏈絲狀噬菌體載體 ）第二十六張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn) （一）M13 DNA 環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大?。?.4kb 結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū) 基因間隔區(qū)（IS區(qū)）第二十七張，PPT共三十七頁(yè)

12、，創(chuàng)作于2022年6月（二）M13DNA復(fù)制和M13噬菌體增殖 M13 DNA“+”鏈進(jìn)入雄性大腸桿菌 合成“-”鏈產(chǎn)生雙鏈M13 DNA（復(fù)制型DNA或RF-DNA） 按環(huán)狀雙鏈DNA方式復(fù)制，同時(shí)以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)譯包裝蛋白 RF-DNA達(dá)200拷貝時(shí)，單鏈DNA特異結(jié)合蛋白與“+”鏈結(jié)合而阻斷合成“-”鏈 結(jié)果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈 “+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體 擠出受體細(xì)胞 受體細(xì)胞不被溶菌。第二十八張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月M13 DNA

13、復(fù)制特征：以雙鏈DNA為中間媒介 培養(yǎng)物高速離心上清中含噬菌體顆?！?”鏈DNA 沉淀菌體破碎后，可提取RF-DNA 第三十一張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑 策略：在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，并組裝合適 RF-DNA上有10個(gè)BsuI位點(diǎn)部分酶切獲得全長(zhǎng)線形RF-DNA, 與含LacZ標(biāo)記的Hind酶切片段進(jìn)行平末端連接M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點(diǎn),可在Lac Z區(qū)插入連桿 構(gòu)建成對(duì)M13載體，保證外源DNA兩條鏈都能隨“+”鏈一起復(fù)制包裝。第三十二張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月HindBHH第三十三張，PPT共三十七頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（四）M13克隆載體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用 優(yōu)點(diǎn)： 1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復(fù)制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作 2、制備的M13 DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)化大腸桿菌，直接轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞