免疫組化(新)課件

1、 張 煦免疫組化技術(shù)及其在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究所2011.10第一部分免疫組化技術(shù)（Immunohistochemistry techniques）一定義： 是應(yīng)用抗原與相應(yīng)抗體接觸后可形成抗原抗體復(fù)合物的化學(xué)反應(yīng)，以檢測組織或細胞內(nèi)抗原或抗體的技術(shù)。1、免疫組化與組織化學(xué)（histochemistry）2、免疫組化與親合組織化學(xué)（affinity histochemistry）3、免疫組化與免疫病理（immunologic pathology）4、免疫細胞化學(xué)與原位雜交免疫細胞化學(xué)（In situ hybridization immunocytochemistry

2、）圖免疫組化與親合組織化學(xué)（affinity histochemistry） 近20多年來，相繼發(fā)現(xiàn)了多種親合物質(zhì)，如：植物凝集素（Lectins）與糖結(jié)合物（glycol conjugates）、葡萄球菌A蛋白（staphylococal proteinA）與IgG、生物素（biotin）與卵白素（avidin）、激素（脂質(zhì)）與受體等。這些物質(zhì)是一些有雙價或多價結(jié)合能力的物質(zhì)，不但親合物質(zhì)之間有高度親合力，而且可以與標記物如：熒光素、酶、同位素、鐵蛋白等相結(jié)合。 Bayer（1976）將這種利用兩種物質(zhì)之間的高度親合力的進行的組織化學(xué)檢測稱為親合組織化學(xué)。雖有人認為它們是免疫組化的進一步發(fā)展

3、，但親合物質(zhì)之間的反應(yīng)并不是抗原與抗體的反應(yīng)。從抗原與抗體互相親合來看，免疫組化倒應(yīng)包括在親合組織化學(xué)之中。隨著親合組織化學(xué)的發(fā)展，一些親合物質(zhì)又被引入免疫組化，使兩種組織化學(xué)技術(shù)融合為一種方法，明顯提高了組織化學(xué)定位的準確性和敏感性。免疫組化與免疫病理（immunologic pathology） 目前，許多人把免疫組化和免疫病理等同起來，認為免疫組化就是免疫病理，實際上二者是有區(qū)別的。狹義的免疫病理學(xué)是指研究異常的免疫反應(yīng)，如變態(tài)反應(yīng)所引起的疾病的病理，也包括自身免疫病和免疫缺陷。 廣義的免疫病理學(xué)則研究所有疾病及病變發(fā)展中的免疫學(xué)機理問題。免疫病理的研究中，免疫組化技術(shù)的確占重要位置，它

4、可以確定組織內(nèi)抗體、補體、抗原，并識別淋巴細胞亞群，但免疫病理的研究方法還包括其他免疫學(xué)方法及一些非免疫學(xué)方法。另一方面，免疫組化可以識別與免疫病理無關(guān)的其他許多抗原，如：病毒、酶、激素等?？梢娒庖呓M化與免疫病理既有密切聯(lián)系，又有明顯區(qū)別，既有交叉又有獨立的內(nèi)容。免疫細胞化學(xué)與原位雜交免疫細胞化學(xué)（In situ hybridization immunocytochemistry） 原位分子雜交技術(shù)引入免疫細胞化學(xué)，是現(xiàn)代免疫細胞化學(xué)向基因水平深入發(fā)展的重要標志。近年來，分子雜交與免疫細胞化學(xué)的結(jié)合日益緊密，尤其是在雜交后信號的檢測技術(shù)，引入免疫細胞化學(xué)和免疫放大和顯色技術(shù)，從而形成雜交免疫組

5、織化學(xué)或稱原位雜交免疫組織化學(xué)，成為免疫組織化學(xué)中又一新的分支。 分子雜交與免疫組織化學(xué)的結(jié)合，形成了在細胞、亞細胞和分子水平同時檢測基因及其表達產(chǎn)物的完整體系，把基因探針（基因工程）和單克隆抗體技術(shù)結(jié)合起來，成為當代生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)在分子水平研究和診斷的新興技術(shù)。尤其是近年來與PCR技術(shù)結(jié)合的原位PCR技術(shù)，敏感性很高，包括分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論、核酸分子探針制備、原位分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、核酸分子雜交電鏡技術(shù)、雜交與免疫細胞化學(xué)雙標記技術(shù)、分子雜交在染色體制片的應(yīng)用和分子雜交基因診斷的應(yīng)用等方面。二免疫組化技術(shù)發(fā)展史1、1941年，Coons等人首次用熒光素標記肺炎雙球菌粘多糖

6、抗體，檢測小鼠組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功，從而開創(chuàng)了免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，并逐漸在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中推廣應(yīng)用。因此，目前一致公認A.H.Coons是免疫細胞化學(xué)的創(chuàng)始人。2、1966年，Nakane和Pierce用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）替代熒光標記抗體，在次基礎(chǔ)上建立了酶標抗體技術(shù)。3、1970年，Sternberger又改良酶標抗體技術(shù)，建立了PAP法（peroxidose-antiperoxidase method）。4、1981年，許世明創(chuàng)立ABC法（avidin-biotin peroxidase complex mothod）比PAP法靈敏

7、2040倍。5、Kohler and Milstein于1975年創(chuàng)立了McAb技術(shù)，較PcAb的抗原性強，進一步提高了免疫組化水平。6、繼ABC法之后，免疫金銀染色法，半抗原標記法和集合免疫細胞化學(xué)技術(shù)等又相繼問世，免疫電鏡技術(shù)繼而迅速發(fā)展。特別是近年來，大量即用型McAb和PcAb的不斷問世和商品化，為免疫組化技術(shù)的推廣和普及奠定了基礎(chǔ)，并使實驗向臨床，向定量和分子水平深入。四 病理診斷準確率HE水平：8590%HE + 免疫組化：95%HE + 免疫組化 + 分子生物學(xué)：98%3、抗體純化：除去抗血清中的其他白蛋白，、球蛋白以及纖維蛋白。（目的：Ab標記時，免受其他蛋白的干擾）4、標記抗

8、體：Marrack于1934年提出了在Ab分子上結(jié)合適當?shù)臉擞浳?，用以識別其相應(yīng)抗原的設(shè)想。Marker種類：熒光色素、酶、金、鐵蛋白、放射性同位素、血漿蛋白、多聚微球蛋白、RBC、 病毒、噬菌體。5、細胞和組織切片標本的制備。6、免疫組化反應(yīng)和顯色。7、觀察和分析結(jié)果。6、滴加抗，置濕盒內(nèi)，4冰箱過夜。7、PBS液洗3x5。8、滴加抗，濕盒內(nèi)室溫30，PBS 洗3x5。9、滴加PAP或ABC試劑，室溫30，PBS洗3x5。10、顯色：DAB液5 15，鏡下控制，PBS沖洗。11、復(fù)染：蘇木素12分鐘，鹽酸酒精分化30秒，蘭化10。12、80%、95%、100%酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封

9、片。七 關(guān)于標記的幾點說明1、阻斷2、消化3、保護4、抗體5、顯色原理：HRP+H2O2 HRPH2O2 HRPH2O2+DH2 HRP+D+2H2O6、鏡下控制八 顯色觀察1、陽性細胞數(shù)2、陽性反應(yīng)強度 3、表達型4、陽性分級5、必須設(shè)對照6、假陽性反應(yīng)7、假陰性反應(yīng)1.非特異性反應(yīng)： 邊緣現(xiàn)象、 皺褶和刀痕、“沙 丘”效應(yīng)、出血和壞死、組織積壓、被動吸收或主動吞噬2.內(nèi)源性過氧化物酶3.抗體的交叉反應(yīng)4.試劑濃度過高或失效1.固定不當或固定時間過長2.抗體效價過低3.其他試劑久置4.切片過薄或過厚5.組織儲存過久6.組織中抗體被粘稠基質(zhì)、分泌物或多層細胞膜阻隔下一頁常用的上皮性標記物1.角

10、蛋白（Keratin,KER;Cytokeratin,CK ）2.上皮（細胞）膜抗原（Epithelial membrane antigen,EMA）3.癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen,CEA）4.包殼蛋白（Involucrin）5.橋粒蛋白（Desmosomal proteins）常用間葉性標記物1.所有間充質(zhì)細胞 波形蛋白（Vimentin,VIM）2.內(nèi)皮細胞 第八因子相關(guān)抗原（Factor related antigen,F- Rag,F8） 荊豆凝集素（Ulex europaeus lectin,REA-1）3.組織細胞 溶菌酶（Lysozyme,mura

11、midase,LYS） 1- 抗胰蛋白酶（1-antitrupsin,AAT） 1- 抗糜蛋白酶（1 antichumotruosin,AACT）肌肉組織標記物1.結(jié)蛋白（Desmin,DMS）2.肌動蛋白（Actin）3.肌球蛋白（Myosin）4.肌紅蛋白（Myoglobin,MG）5. 肌酐激酶BB和MM（Creatinine kinase BB&MM）6.Z-蛋白（Z-protein）淋巴造血組織標記物1.白細胞共同抗原（Leucocyte common antigen,LCA,CD45）；2.免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）輕鏈（、）重鏈（、）；3.全B細胞單克隆抗體

12、：CD19（B4）、CD20（B1）、CD22（Leu14）、L26；4.全T細胞單克隆抗體：CD2（OKT11,Leu5）、CD3（OLT3,Leu4）、CD5（OKT1,Leu1）、CD7（Leu9）、UCHL1;干細胞前B細胞B1中心母細胞中心細胞邊緣帶細胞B2漿細胞免疫母細胞漿樣細胞骨髓淋巴結(jié)B細胞的發(fā)育轉(zhuǎn)化示意圖B1：套細胞B2：記憶細胞抗原刺激活化的淋巴樣母細胞濾泡母細胞T細胞的分化演變過程 T1免疫母細胞T2骨髓胸腺外周淋巴組織及血液NK（細胞毒）曲核細胞抗原抗原T-LBL/T-ALL母細胞NK淋巴瘤肝脾T細胞T-PLL/T-CLL細胞毒： 皮下脂膜炎樣、腸病型、T-LGL、AL

13、CL（皮）、 ALCL（系統(tǒng)）、（肝脾T）NK細胞：侵襲性NK白血病、NK/T鼻型、（母細胞NK淋巴瘤）T細胞： 非特殊類型外周T、成人T、蕈樣霉菌病、 血管免疫母細胞、（T-PLL/T-CLL） 細胞毒、抑制、輔助中樞和周圍神經(jīng)標記物1.膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acdic protein,GFAP）；2.神經(jīng)微絲蛋白（Neurofilament proteins,NFP）；3.S100蛋白（S100 protein, S100）；4.髓磷脂堿性蛋白（Myelin basic protein,MBP）；5.Leu7；6.神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron speci

14、fic enolase,NSE）。神經(jīng)內(nèi)分泌細胞一般性標記物1.神經(jīng)原特異性烯醇化酶（NSE）2.嗜鉻顆粒蛋白（Chromogranin A,CHG-A）3.嗜鉻顆粒膜蛋白（Chromomembrin B,CHM-B）4.突觸囊泡蛋白（Synaptophysin,SY ）5.Leu7激素標記物1.垂體激素：促腎上腺皮質(zhì)素（ACTH）、生長素（GH）、泌乳素（LTH）、促甲狀腺素（TSH）、促卵泡成熟素（FSH）、黃體生成素（LH）2.胰島細胞、胃腸道和呼吸道激素：胰島素（Insulin）、胰高血糖素（Glucagon）、胰多肽（Pancreatic polypeptide,PP）、生長抑素（S

15、omatostatin）、胃泌素（Gastrin）、血管活性腸多肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）、5-羥色胺（Serotonin）、蛙皮素（Bombesin）、降鈣素（Calcitonin）和ACTH等3.其他：甲狀腺素（T3、T4）、腎上腺素和去甲腎上腺素、絨毛膜促性腺激素（hCG）。 瘤胚性抗原標記物1.癌胚抗原（CEA）2.甲胎蛋白（1-fetoprotein,AFP）即用型抗體和S-P試劑盒的商品化，方便了基層，使得推廣應(yīng)用免疫組化技術(shù)成為可能。由于發(fā)展的不平衡性，急需對初建免疫病理室的技術(shù)人員進行全面培訓(xùn)，給予技術(shù)上的指導(dǎo)，實現(xiàn)人員培訓(xùn)基地化，試劑供給定點化，技術(shù)操作規(guī)范化