脫細(xì)胞脊髓天然支架的制備及形態(tài)學(xué)觀察

1、脫細(xì)胞脊髓天然支架的制備及形態(tài)學(xué)觀察【摘要】目的采用化學(xué)脫細(xì)胞方法去除細(xì)胞和髓鞘成分制作細(xì)胞外基質(zhì)支架，為橋接脊髓損傷缺損提供理想的天然神經(jīng)支架。方法取SD大鼠胸段脊髓約2，運用凍融+化學(xué)萃取3%脫氧膽酸鈉和1KU/lDNasEi、RNaseA的組織工程學(xué)方法處理大鼠脊髓組織，并對處理后的脊髓支架分別進(jìn)展組織學(xué)檢查，理解脫細(xì)胞情況及細(xì)胞外基質(zhì)支架形態(tài)。結(jié)果經(jīng)過脫細(xì)胞處理后，光鏡下HE染色脊髓橫斷面呈網(wǎng)狀構(gòu)造，未見細(xì)胞成分存留，縱切面上呈互相交織的管狀通路；未見軸突、髓鞘和細(xì)胞核。髓鞘染色可見髓鞘脫除徹底，未見髓鞘成分。結(jié)論本實驗采用凍融+化學(xué)萃取的組織工程學(xué)方法可制備出理想的天然脊髓支架，該支

2、架與脊髓三維組織構(gòu)造具有高度相似性，有望作為脊髓損傷后橋接物和神經(jīng)組織工程種子細(xì)胞的支架,本實驗結(jié)果顯示3%脫氧膽酸鈉和1KU/lDNasEI、RNaseA進(jìn)展脫細(xì)胞處理兩次是較為適宜的，能較為徹底去除細(xì)胞及髓鞘成分并較為完好地保存細(xì)胞外基質(zhì)的三維構(gòu)造?！娟P(guān)鍵詞】脫細(xì)胞脊髓組織工程支架大鼠近年來，以組織工程技術(shù)修復(fù)脊髓損傷是研究的一個新熱點。在構(gòu)建組織工程化脊髓的過程中包括兩個最根本的問題，即組織工程支架和種子細(xì)胞。其中支架材料及三維構(gòu)造對治療效果具有至關(guān)重要的作用。目前應(yīng)用的組織工程支架材料在物理性能、生物性能及其形態(tài)構(gòu)造與正常的在體脊髓相比，都有較大的差距，尚無與脊髓三維構(gòu)造高度相似且在理

3、化性能也與脊髓相似的支架材料，因此本研究試圖探究運用凍融+化學(xué)萃取的組織工程學(xué)方法制備脫細(xì)胞的天然脊髓支架，從而為脊髓損傷修復(fù)提供理想的支架材料。1材料與方法1.1材料與儀器SD大鼠第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，脫氧膽酸鈉(北京奧博星公司)，DNaseI、RNaseA(華美生物工程公司)，恒溫盤旋振蕩器(重慶儀器)，鐵明礬、硼砂及鐵氰化鉀為新橋醫(yī)院病理科惠贈。1.2大鼠脫細(xì)胞脊髓支架的制備以戊巴比妥鈉將SD大鼠經(jīng)腹腔麻醉，背部去毛后消毒，取后正中切口，翻開椎板，顯露脊髓，取胸段脊髓約2。PBS緩沖液清洗，去除外表血跡，參照Ribatti等1方法并加以改良：(1)脊髓置于-80深低溫冰箱中凍

4、存1h，室溫下解凍；(2)將脊髓組織置于蒸餾水內(nèi)，在室溫下浸泡6h，每2h換液1次；(3)置于3%的脫氧膽酸鈉鹽蒸餾水溶液參加適量1l/LNaH至溶液pH值為89連續(xù)震蕩4h恒溫盤旋振蕩器內(nèi)持續(xù)振蕩，25100轉(zhuǎn)/分；(4)蒸餾水中振蕩浸泡3h，1h換液1次；(5)置于1KU/lDNase和RNase混合液中持續(xù)振蕩30in；(6)蒸餾水浸泡3h，1h換液1次;(7)重復(fù)(3)(6)再萃取1遍，最后將萃取后的脊髓組織置于冷凍枯燥機(jī)中凍干，60照射消毒，照射劑量2.5Gy，消毒后-80冰箱保存。1.3組織學(xué)觀察1.3.1HE染色將化學(xué)萃取的脊髓支架和大鼠正常脊髓用10%中性甲醛緩沖液固定，常規(guī)石

5、蠟包埋，兩種標(biāo)本均行橫切片和縱切片，切片后進(jìn)展HE染色，光鏡觀察。1.3.2髓鞘染色(eil髓鞘染色法)組織切片厚58，脫蠟至水，eil蘇木精50，15in10%純酒精性蘇木精5l，4%鐵明礬50l，蒸餾水45l，自來水洗15in，4%鐵明礬分化至灰白質(zhì)分辨明顯，必要時用eigert分化液補充分化硼砂2g，鐵氰化鉀2.5g，蒸餾水200l，自來水洗，脫水，透明，封片，光鏡觀察。2結(jié)果2.1肉眼觀察在脫細(xì)胞、蒸餾水浸泡過程中可見大量白色絮狀物自脊髓內(nèi)析出，脫細(xì)胞處理的脊髓支架顏色呈乳白色，半透明狀，仍維持圓柱形，粗細(xì)為處理前的2/34/5，略變短。強度略有下降，韌性與處理前脊髓組織相似，黏性略有

6、增加。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2HE染色正常大鼠脊髓橫切面構(gòu)造，含有大量神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，組織構(gòu)造致密，髓鞘存在。脫細(xì)胞處理所獲得的脊髓支架橫切面上呈大小不等的網(wǎng)眼狀構(gòu)造(圖1)，軸突及髓鞘均已消失，未見細(xì)胞成分存在?？v切面可見脊髓支架呈交織的縱行管狀構(gòu)造(圖2)。2.3髓鞘染色正常脊髓切面上可見髓鞘染色呈黑色，無明顯破壞，形態(tài)規(guī)那么，厚度正常圖3，脫細(xì)胞脊髓未見髓鞘成分或存在極少量髓鞘碎片圖4。圖1大鼠脫細(xì)胞脊髓橫切面，細(xì)胞脫除徹底，組織呈網(wǎng)狀構(gòu)造HE200略圖2大鼠脫細(xì)胞脊髓縱切面，未見細(xì)胞成分，組織構(gòu)造呈交織縱管狀HE200略圖3正常大鼠脊髓Eil染色，髓鞘構(gòu)造正常，形態(tài)規(guī)那么400略

7、圖4大鼠脫細(xì)胞脊髓EIl染色，髓鞘構(gòu)造消失，無細(xì)胞成分存在400略3討論脊髓損傷后軸突再生和功能恢復(fù)一直是骨科及神經(jīng)外科的難題，雖然近年來脊髓損傷修復(fù)獲得了一定的進(jìn)步，但仍未獲得打破性進(jìn)展。組織工程技術(shù)通過構(gòu)建支架并復(fù)合適宜的種子細(xì)胞，為軸突再生提供良好的通路，促進(jìn)移植細(xì)胞存活并提供必需的營養(yǎng)成分，創(chuàng)造合適軸突生長的微環(huán)境，因此近年來成為研究的熱點，呈現(xiàn)良好的開展勢頭。但是目前應(yīng)用的天然或人工合成材料作為脊髓損傷的支架，其孔隙均通過人工方法制作而成，難以真正模擬正常脊髓傳導(dǎo)通路的構(gòu)造，而且這些支架材料均各有一定的缺點，如：在降解過程中會產(chǎn)生一些降解產(chǎn)物不利于神經(jīng)元的存活和軸突的再生；與細(xì)胞的低

8、黏附性；支架的生物特性、物理特性與正常脊髓相距甚遠(yuǎn)，不具有仿生性。而且由于制作工藝的限制和脊髓組織構(gòu)造的復(fù)雜性，目前尚不能制作出與脊髓高度相似的三維網(wǎng)狀構(gòu)造。同種異體脊髓具有與受體脊髓一樣或相似的三維構(gòu)造，而且胚胎脊髓移植已證實具有促進(jìn)功能恢復(fù)的作用，胚胎脊髓移植涉及倫理問題和來源問題的困擾，而成體異體脊髓那么存在強烈的免疫排擠反響。目前已證實排擠反響主要是由細(xì)胞成分和髓鞘引起，而細(xì)胞外基質(zhì)成分的免疫原性在同種動物間非常微弱。去除細(xì)胞和髓鞘成分后免疫原性將顯著降低，這在周圍神經(jīng)支架中已得到了證實24，并且具有良好的功能促進(jìn)作用5、6。本研究運用凍融結(jié)合化學(xué)萃取的組織工程學(xué)方法來處理大鼠脊髓組織

9、，率先成功制備了天然的脊髓細(xì)胞外基質(zhì)支架，在既往文獻(xiàn)中尚未見有報道。在凍融破壞細(xì)胞的根底上，應(yīng)用脫氧膽酸鈉進(jìn)一步破壞細(xì)胞，同時利用脫氧膽酸鈉在堿性條件下作用增強的特點，參加適量NaH從而增強其破壞細(xì)胞才能，而且NaH本身具有細(xì)胞破壞作用7，在此根底上再參加核酸酶徹底破壞細(xì)胞及細(xì)胞核。在實驗過程中作者體會蒸餾水浸泡和沖洗時間一定要充足，才能保證將破壞的細(xì)胞成分全部從組織中去除。從組織學(xué)檢查結(jié)果來看，脫細(xì)胞處理的神經(jīng)支架內(nèi)未見軸突、髓鞘、細(xì)胞殘留物，說明已較徹底去除了細(xì)胞和髓鞘構(gòu)造，經(jīng)初步研究具有良好的組織相容性另文發(fā)表。本實驗制作的脊髓支架是一種仿生的天然三維立體管狀支架材料，與上述的生物降解材料移植物相比有著根本的不同和先天的優(yōu)越性。該支架還具有一些其他支架所不具備的優(yōu)點，如易于獲得、不受長度和口徑的限制、可進(jìn)展“等位移植如L1脊髓損傷，那么制備L1節(jié)段脊髓支架進(jìn)展移植確保構(gòu)造的相似和“解剖移植即移植物前角與受體脊髓前角相對應(yīng)進(jìn)展移植，進(jìn)一步到達(dá)構(gòu)造相似，對受者不良影響孝易于保存、制作工藝簡單等等。在脫細(xì)胞的同時該支架保存了細(xì)