凱氏定氮法實驗報告

1、凱氏定氮法實驗總結題目：蛋白質濃度測定（微量凱氏定氮法）姓名：穆拉地力地力夏提學號：074031141一、【實驗目的】掌握凱氏定氮法測定蛋白質含量的原理和方法學會使用凱氏定氮儀并學會用凱氏定氮儀測出小油馕中的蛋白質含量二、【實驗原理】凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經一系列的分解、碳化和氧化 還原反應等復雜過程，最后有機氮轉變?yōu)闊o機氮硫酸銨，這一過程稱為有機物的 消化。為了加速和完全有機物質的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸 鉀、硫酸銅、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物 分解，硫酸銅起催化劑的作用。使用時常加入少量過氧化氫作為氧化劑以加速有 機物氧化。

2、消化完成后，將消化液轉入凱氏定氮儀反應室，加入過量的濃氫氧化 鈉，將NH4+轉變成NH3,通過蒸餾把NH3驅入過量的硼酸溶液接受瓶內，硼酸接 受氨后，形成四硼酸銨，然后用標準鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子 濃度。滴定消耗的標準鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù),通過計算即可得出總氮量。 在滴定過程中，滴定終點采用甲基紅-次甲基藍混合指示劑顏色變化來判定。測 定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機氮和無機氮。以甘氨酸為例，其反 應式如下： TOC o 1-5 h z NH2CH2COOH+3H2SO4 =2C02+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3 +H2SO4 = （NH4）2SO4

3、（NH4）2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH（3）反應（1），（2）在凱氏燒瓶內完成，反應（3）凱氏蒸餾燒瓶中進行（圖1）。 蛋白質是一類復雜的含氮化合物，每種蛋白質都有其恒定的含氮量（約在 14 18，平均為16）。凱氏定氮法測定出的含氮量，再乘以系數(shù)6.25，即為蛋 白質含量。三、【試驗器材】凱氏定氮儀電爐消化架錐形瓶 100ml （X5）量筒 10ml（X 1）滴定管（5ml,可讀至0.02ml）凱氏燒瓶（X2）玻璃珠吸耳球10移液管（2ml, 5ml, 10mlX1）四、【實驗試劑】濃硫酸（AR）2. 硫酸鉀-硫酸銅混合物：硫酸鉀3 份與硫酸銅1 份混合研磨成粉末。4

4、0%氫氧化鈉溶液：30g氫氧化鈉溶于蒸餾水，稀釋至100ml。2%硼酸溶液：2g硼酸溶于蒸餾水，稀釋至100ml。混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液和0.1%甲烯藍乙醇溶液按體積比4:1混合。0.00963mol/L 標準鹽酸溶液：用恒沸鹽酸準確稀釋標定。五、【實驗操作】1樣品的消化將兩個 50mL 的凱氏定氮燒瓶編號（在燒瓶口附近），一只燒瓶內加 1.0mL 蒸餾水，作為空白。另一只燒瓶內加入1.0mL樣液。然后用取樣器各加濃硫酸 4mL （取濃硫酸時勿濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實驗桌上），用藥勺加硫酸 鉀一硫酸銅混合物約200mg （不必稱重，一點點即可），所有試劑要盡量加到凱 氏定氮燒

5、瓶的底部。燒瓶口插上小漏斗（作冷凝用），燒瓶置通風櫥內的電爐上 加熱消化，注意先啟動抽風機在消化開始時，應控制火力，不要使沸液沖到瓶頸。 待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續(xù)消化， 直至消化液呈透明藍綠色為止。消化時間為23h，冷卻，準備蒸餾。在消化時 可以同時進行第二步。2定氮儀的洗滌凱氏微量定氮蒸餾裝置1.電爐 2.蒸汽發(fā)生燒瓶 3.玻璃管 4.橡皮管 6.反應室 7.玻璃杯8.氣水分離器 9.冷凝管10.錐形瓶11.棒狀玻璃塞12.廢液排出管儀器應先經一般洗滌，再經水蒸氣洗滌。蒸氣發(fā)生器中裝加有h2so4的蒸餾水和數(shù)粒沸石，加甲基橙指示劑后顯粉紅 色。加熱后

6、，產生的蒸汽經貯液管、反應室至冷凝管，冷凝液體流入接受錐形瓶 瓶。每次使用前，需用蒸汽洗滌 5 分鐘左右（此時可用一小燒杯承接冷凝水）。 將一只盛有5mL 2%硼酸液和12滴混合指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端，使 冷凝管管口插入液體中，繼續(xù)蒸餾3分鐘，如硼酸液顏色不變，表明儀器已洗凈。 若硼酸的顏色變?yōu)榈G色，說明定氮儀內有殘留氨，需要進一步用蒸汽洗滌。若 反應室內有上次操作剩余的殘夜，可以通過圖 1 中 7 向反應式加冷的蒸餾水，然 后短時間關閉 4，則殘夜會倒吸回貯液管，重復幾次，并用蒸汽洗滌幾分鐘，再 用上述方法檢驗是否已經洗干凈。打開 12 廢液排出管的夾子可以將廢液放出。3標準品練習（

7、標準硫酸銨溶液，含氮量 0.3mg/ml）儀器洗好后，取一 100ml 錐形瓶，加入 5ml 硼酸溶液，并使冷凝管下端玻 璃管插入硼酸溶液中。取下11 （圖1）棒狀玻璃塞，利用2ml移液管準確向反應 室加入 2ml 硫酸銨溶液，然后將玻璃塞放回，向 7（圖 1）玻璃杯中加入 10ml30%NaOH 溶液，旋轉棒狀玻璃塞，將氫氧化鈉溶液緩慢地放入反應室中， 并留少量液體作水封。等到錐形瓶內的硼酸溶液由紫紅色變?yōu)轷r綠色后開始計 時，繼續(xù)蒸餾3min,然后移動錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，繼續(xù)蒸餾1min。 并用少量蒸餾水洗滌冷凝口外圍，移去錐形瓶。立即用標準鹽酸溶液進行滴定， 如果用滴定結果計

8、算出的標準硫酸銨中氮含量接近于0.3mg/ml。則說明整個實 驗操作正確，可以進行下一步。4樣品測定儀器洗好后，取一 100ml 錐形瓶，加入 5ml 硼酸溶液，并使冷凝管下端玻 璃管插入硼酸溶液中。取下 11 棒狀玻璃塞，利用 2ml 移液管準確向反應室加入 2ml 消化好的樣品溶液，然后將玻璃塞放回，向 7 玻璃杯中加入 10ml30%NaOH 溶液，旋轉棒狀玻璃塞，將氫氧化鈉溶液緩慢地放入反應室中，并留少量液體作 水封。等到錐形瓶內的硼酸溶液由紫紅色變?yōu)轷r綠色后開始計時，繼續(xù)蒸餾 3min, 然后移動錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm，繼續(xù)蒸餾1min。并用少量蒸餾水 洗滌冷凝口外圍，移去

9、錐形瓶。立即用標準鹽酸溶液進行滴定，按上述方法洗滌 儀器準備下一次蒸餾。重復蒸餾并滴定三次。將 2ml 消化好的樣品溶液改為 2ml 消化后的空白對照溶液，其他操作同上， 測量三組。三組空白測量中，若錐形瓶中的硼酸溶液不變色，則無需滴定。六、【注意事項】 1凱氏法的優(yōu)點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織，器官及食品等成組 復雜樣品的測定，只要細心操作都能得到精確的結果。其缺點是操作比較復雜， 含有大量堿性氨基酸的蛋白質測定結果偏高。2普通實驗室中的空氣中常含有少量的氨，會影響結果，所以操作應在單獨潔 凈的房間中進行，并盡可能快地對硼酸吸收液進行滴定。3定氮儀各連接處應使玻璃對玻璃外套橡皮管絕

10、對不能漏氣。蒸餾時需控制火 力以避免樣液倒吸。4消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫 噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失?？杉尤肷倭啃链蓟蛞后w石蠟，或硅消泡劑減少泡 沫產生。5消化時應注意旋轉凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。 若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后， 再繼續(xù)加熱消化至完全。6蒸餾時，加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外，還與消化液中的硫酸和硫 酸銅作用。若加入的氫氧化鈉不夠，則溶液呈藍色，不生成褐色的氫氧化銅沉淀。所以，加入的氫氧化 鈉必須過量，并且動作還要迅速，以防止氨的流失。7蒸氣發(fā)生瓶內的水裝至 2/3

11、體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶內的水中加入 稀硫酸，使之呈酸性，內加甲基橙指示劑數(shù)滴，水應呈橙紅色，如變黃時，應該 補加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出，使結果偏大。8因蒸餾時反應至外層的氣壓大于反應室內的壓力，而反應室的壓力大于大氣 壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時，蒸氣要均勻、充足，蒸餾中不得?；饠鄽猓?否則，會發(fā)生倒吸。停止蒸餾時，由于反應室外層的壓力突然降低，可使液體倒 吸入反應室外層，所以，操作時，應先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸 1min 后關掉熱源。C(A-B)X C(A-B)X 14.008X4V123平均標準品練習4.40空白10.090.130.110.11樣品

12、32.752.922.862.841結果表一各組實驗消耗的標準鹽酸體積（ml）2計算式中m：樣品中的含氮的質量，即4ml樣品中含氮量（mg） A：滴定樣品消耗的HCl溶液體積（ml）B：滴定空白消耗的HCl溶液體積（ml） V：相當于未稀釋樣品的體積（ml） c：鹽酸物質的量濃度（m ol/L） 14.008：每摩爾氮原子質量（g/mol） 4： 4ml 樣品所以可得：1.所以可得：1.標準硫酸銨中的N含量：m =0.00963 X 4.40 X 14.008X42=0.297mg該結果與標準值的相對誤差=（0.2970.3） /0.3X100 =1，這表示我 們整個的實驗操作正確。2 .蛋清

13、中 N 含量（100ml 樣品）：m = 0.00963X（2.84011）X14008X1002 =18.41 mg3若樣品中含氮物均為蛋白質，則蛋清樣品中蛋白質的含量為：18.41X6.25 = 115.063 mg八、【結果分析及討論】1分析：在測量標準硫酸銨中含氮量時，我們測得的結果為0.297mg/ml，而標準 值為0.3mg/ml,相對誤差為1%,這說明我們組的實驗儀器狀態(tài)良好，而且操作也 是正確規(guī)范的。在測定樣品中氮含量時，我們的測定結果為18.41mg N /ml,而且三組測 量數(shù)據(jù)的相對偏差分別為2.55%， 2.23%， 0.76%，可見相互之間偏差很小，即實 驗準確性較高。由此推出實驗室提供樣品含氮量也應該在 18.41mg N/ml 左右。2討論：本實驗定氮的目的是確定樣品中蛋白的含量，使用凱氏定氮法測定蛋白含量 具有許多優(yōu)點。該方法可用于食品的蛋白質分析，操作相對比較簡單，實驗儀器 和實驗試劑相對比較便宜，并且結果準