蛋白質(zhì)分離純化步驟

1、一、蛋白質(zhì)分別純化的一般原則大多數(shù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中都是和核酸等生物分子結(jié)合在一起 程序以獲得高純度的制品。且分別的關(guān)鍵步驟、根本手段還是共同的。蛋白質(zhì)提純的目的是增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量 性。因此，要分別純化某一種蛋白質(zhì)，首先應(yīng)選擇一種含目的蛋白質(zhì)較豐富的材料。其次， 04 要設(shè)法除去變性的蛋白質(zhì)和其它雜蛋白，從而到達(dá)增加純度和提高產(chǎn)量的目的。二、分別純化蛋白質(zhì)的一般程序分別純化蛋白質(zhì)的一般程序可分為以下幾個(gè)步驟：一材料的預(yù)處理及細(xì)胞裂開(kāi)方法有：機(jī)械裂開(kāi)法這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用勻漿器、研缽等。滲透裂開(kāi)法這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而裂開(kāi)。反復(fù)凍融法那些對(duì)溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜承受此法

2、。超聲波法使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞裂開(kāi)。酶法如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。(二) 蛋白質(zhì)的抽提pH 一般要參加外表活性劑tritonX-100 等，使膜構(gòu)造破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分別。在抽提過(guò)程中，應(yīng)留意溫度，避開(kāi)猛烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。(三蛋白質(zhì)粗制品的獲得選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分別開(kāi)來(lái)依據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)展的分別。常用的有以下幾種方法：等電點(diǎn)沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分別。鹽析法不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其自然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。有機(jī)溶劑沉淀法變性，使用該法時(shí)，要

3、留意在低溫下操作，選擇適宜的有機(jī)溶劑濃度。四樣品的進(jìn)一步分別純化析、親和層析等等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾層析gel-filtration chromatography又稱(chēng)為分子排阻層析或分子篩層析。它是將葡聚糖凝膠Sephadex裝入一個(gè)柱子中，制成凝膠柱。這種凝膠顆粒具有分子大小不同，進(jìn)入網(wǎng)孔的程度不同，因此流出的速度不同，洗脫所用體積準(zhǔn)時(shí)間不同，從而到達(dá)分別的目的。纖維素柱層析法該法是利用蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)作為分別的根底。離子交換纖維素celluloseion-exchanger是人工合成的纖維素衍生物，它具有松散的親水性網(wǎng)狀構(gòu)造，有較

4、大的外表積，使蛋白質(zhì)大分子可以自由通過(guò)。因此常用于蛋白質(zhì)的分別。1羧甲基纖維素CM-纖維素在纖維素顆粒上帶有羧甲基基團(tuán)。在中性pH 條件下，羧甲基上的質(zhì)子可解離下來(lái)圖 2-27a，而溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)分子可與纖維素顆粒上的羧甲基負(fù)電荷結(jié)合。可 小取決于彼此間相反電荷基團(tuán)之間靜電吸引。(2二乙氨基乙基纖維素DEAE-纖維素在中性pH可交換的基團(tuán)帶負(fù)電荷，因此是一種陰離子交換劑。當(dāng)某一蛋白質(zhì)混合溶液通過(guò)裝有DEAE- pH 和離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)展洗脫，轉(zhuǎn)變蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷，依次從層析柱流出到達(dá)相互分別的目的。親和層析親和層析affinity-chromatography分別技術(shù)是依據(jù)很多

5、蛋白質(zhì)對(duì)特定的化 配基或配體ligand。親和層析是一種極有效的分別純化蛋白質(zhì)的方法。例如酶對(duì)它的底物具有特別的親和力；抗原和抗體互為配基。以伴刀豆球蛋白Aconcanavalin A的分別純地連接到像瓊脂糖凝膠一類(lèi)的載體外表上或稱(chēng)為間隔臂， spacerarm，使配體與載體之間保持足夠的距離。將這種多糖顆粒裝入肯定規(guī)格的玻璃管中就制成了一根親和層析柱合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能與葡萄糖配基結(jié)合將通過(guò)柱子而流出圖2-28a。然它蛋白質(zhì)分別的目的。 三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)分子量測(cè)定的方法很多，目前常用的方法有以下幾種。一凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理如“分別純化方法”中所述

6、 后能夠進(jìn)入顆粒的蛋白質(zhì)也按分子量大小而先后被洗脫下來(lái) 應(yīng)的分子量來(lái)。二SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定分子量蛋白質(zhì)在一般聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子大小量以及分子外形。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳與此不同的是在樣品及電泳緩沖液中參加了 十二烷基硫酸鈉sodium dodecyl sulfate,SDS。SDS變性并解離成亞基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品中參加SDS0.1后，SDS量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)之間的電荷差異。全部結(jié)合SDS-SDS了蛋白質(zhì)之間原有的電荷和外形的差異，電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。下電泳，依據(jù)測(cè)得的樣品相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上便可查出其分子量。三沉降法蛋白質(zhì)顆

7、粒在離心場(chǎng)中的沉降速度用每單位時(shí)間內(nèi)顆粒下沉的距離來(lái)表示。離心力減去浮力與溶劑的摩擦力平衡時(shí)，每單位離心場(chǎng)強(qiáng)度的沉降速度稱(chēng)為沉降系數(shù)Sedimentation Coefficient。國(guó)際上承受Svedberg 單位作為沉降系數(shù)的單位，用S 表示，以紀(jì)念超速離心法的創(chuàng)始人，瑞典有名的蛋白質(zhì)化學(xué)家T.SvedberSvedberg或直接稱(chēng)一個(gè)為11013。110132001013s1S200S。蛋白質(zhì)分別純化的一般程序可分為以下幾個(gè)步驟：一材料的預(yù)處理及細(xì)胞裂開(kāi)活性。所以要承受適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞裂開(kāi)。常用的裂開(kāi)組織細(xì)胞的方法有：機(jī)械裂開(kāi)法這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用，使細(xì)胞裂開(kāi)。常用設(shè)備有

8、，高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。滲透裂開(kāi)法這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而裂開(kāi)。反復(fù)凍融法敏感的蛋白質(zhì)不宜承受此法。超聲波法使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞裂開(kāi)。酶法(二) 蛋白質(zhì)的抽提通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來(lái)。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)依據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要參加外表活性劑十二烷tritonX-100，使膜構(gòu)造破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分別。在抽提過(guò)程中，應(yīng)留意溫度，避開(kāi)猛烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。三蛋白質(zhì)粗制品的獲得差異進(jìn)展的分別。常用的有以下幾種方法：等電點(diǎn)沉淀法不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分別。2. 鹽析法2. 鹽析法不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過(guò)調(diào)整鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其自然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。3. 有機(jī)溶劑沉淀法中