藥物分析之藥物的含量測定

1、藥物的含量測定本章要求熟悉藥物及其制劑的含量限度表示方法掌握容量分析法的特點、原理與含量計算方法掌握UV法測定藥物含量的原理、測定方法與計算掌握HPLC法和GC法的系統(tǒng)適用性試驗、含量計算熟悉常用HPLC、GC色譜柱、檢測器、條件的選擇熟悉藥物含量測定分析方法的驗證實驗了解熒光分光光度法和原子吸收分光光度法的應用評價藥品質(zhì)量的三種分析手段：鑒別（identification）檢查（test for purity）含量測定（assay）準確測定有效成分的含量優(yōu)劣度 第一節(jié) 概述含量測定（assay）理化方法測定 效價測定（assay of potency）生物學方法或 酶學方法測定原料藥：強調(diào)方

2、法的精密度、準確度 制劑：偏重方法的選擇性含量限度的表示方法原料藥：以百分含量表示（一般以干燥品計）地塞米松磷酸鈉 按干燥品計算，含C22H28FNaO8P應為96.0%-102.0%。硫酸慶大霉素 按無水物計算，每1mg的效價不得少于590慶大霉素單位。阿司匹林含C9H6O4不得少于99.5% 氫氧化鋁含氫氧化鋁按Al2O3計算，不得少于48.0。例子101.0%干燥失重測定水分測定以標示量%表示直接用%含量規(guī)定范圍以重量規(guī)定含量范圍標示量=規(guī)格量=處方量例：維生素B1注射液含維生素B1 應為標示量的95.0%105.0%例：復方碘溶液 含 I 應為4.50% 5.50% 含 KI 應為9.

3、5% 10.5%例：復方磺胺甲噁唑片磺胺甲噁唑 0.3600.440g /片 甲氧芐氨嘧啶72.088.0mg /片制劑：按標示量計算（一般以干燥品計）常用含量測定方法(2005年版ChP） 儀器法 容量法 其他法 HPLC 29.4%非水法 15.3%生物學 8.1%VIS-UV 21%酸堿法 7.5%重量法 0.8%旋光 0.5%銀量法 3.4%原子吸收 0.3%碘量法 3.3%GC 0.3%EDTA法 2.9%熒光 0.1%亞硝酸鈉法 2.1%其他容量法 5%特點：操作簡便、快速、實驗條件易實現(xiàn)，但是靈敏度低，專屬性差 通常用于高含量和中含量的原料藥物 (只要求準確度和精密度)滴定方式：

4、 直接滴定法 剩余滴定法 置換滴定法 第二節(jié) 容量分析法（滴定）滴定類型：關(guān)鍵問題：滴定終點的把握 被測物與滴定液定量關(guān)系 滴定液消耗的體積 酸堿滴定法 非水滴定法 氧化還原滴定法（碘量法） 溴量法 反應的化學計量點指示劑顯示的滴定終點直接滴定法 含量含量的計算定量關(guān)系： aA bB 被測藥物 滴定液化學計量關(guān)系 nA/ anB/ b WA/ aMAWB/ bMB滴定度：1mL某物質(zhì)的量濃度的滴定液相當于被測藥物的重量，中國藥典用mg表示。滴定度的計算：T滴定度(mg/ml) c滴定液濃度(mol/L)M被測物質(zhì)分子量以I2（0.05mol/l）計，反應摩爾比 11例子濃度校正因子F：實際工作

5、中配制的滴定液濃度與藥典中的規(guī)定濃度不一致，須對滴定液濃度校正含量計算公式含量 100F 含量剩余滴定法 加入滴定液A 與被測藥物完全反應，再以滴定液B 回滴剩余的滴定液 A 滴定液A 與滴定液B 的濃度是相當?shù)?，根?jù)消耗回滴的滴定液體積進行計算 本法需進行空白試驗校正含量 100 稱取異煙肼約0.25g，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取25mL，加水50 mL與鹽酸20 mL，加甲基橙指示液1滴，用溴酸鉀滴定液(0.01667mol/L)緩緩滴定至粉紅色消失。 已知：異煙肼取樣0.2545g ， 消耗溴酸鉀滴定液(F=1.005) 18.30mL，每1mL溴酸鉀滴定

6、液（0.01667 mol/L）相當于3.429mg異煙肼。百分含量%=V TF/ W100% 例子 18.30 3.4291.005 0.254525/100103 100% =99.1%=取阿司匹林約0.3g，精密稱定（0.2908g），加中性乙醇20ml溶解后，精密加入0.1mol/L NaOH40ml，置水浴中加熱煮沸15分鐘，放冷，用0.05mol/L H2SO4滴定至終點，同時用空白試驗進行校正。每1ml 0.1mol/L NaOH相當于18.02mg阿司匹林。已知：供試品消耗硫酸滴定液（0.05015mol/L） 23.84ml，空白試驗消耗硫酸滴定液（0.05015mol/L）

7、 39.88ml。 2NaOH（過量）H2SO4 Na2SO42H2O百分含量%=(V0-V) TF/ W100% (39.88-23.84) 18.020.2908 103100%= 99.4%例子原料藥百分含量制劑標示量百分含量片劑：每片含量相當于標示量的%每g實際含量區(qū)分每mL實際含量注射劑：每mL含量相當于標示量的%片粉重注射液體積取阿司匹林片10片，稱總重，研細后稱取適量，精密稱定，加中性乙醇20ml后，迅速用0.1mol/L NaOH滴定至終點 。精密加入0.1mol/L NaOH40ml，置水浴中加熱煮沸15分鐘，放冷，用0.05mol/L H2SO4滴定至終點，同時用空白試驗進

8、行校正。每1ml 0.1mol/L NaOH相當于18.02mg阿司匹林。例子已知：10片重3.0840g，取片粉0.2908g，供試品及空白試驗分別消耗硫酸滴定液（0.05015mol/L） 23.84ml、 39.88ml，規(guī)格0.3g/片標示量 100(39.88-23.84) 18.020.2908 103100%0.30840.3利用物質(zhì)的光譜特性進行定量 （吸光度、發(fā)光強度與濃度成正比關(guān)系）紫外可見分光光度法熒光分光光度法原子吸收紫外吸收光譜圖 第三節(jié) 光譜分析法波長范圍200760nm定量分析基本原理：朗伯-比爾定律 A=ECL特點：靈敏度高(10-410-7 g/mL)； 準確

9、度高； 儀器便宜；易操作 專屬性稍差紫外可見分光光度法（一）對溶劑的要求 列出名稱、A盡量?。ǘ┤軇┛瞻自囼?校零（四）測定波長確證 2nm（三）供試液的濃度 A=0.30.7吸收度的測定要求測定方法對照品比較法:配制供試品溶液和對照品溶液， 相同條件下測定吸收度 C供試C對照 要求：對照品與供試品溶液中的被測成分濃度應一致（標示量的 10%）含量 100=標準曲線法（多點對照）繪制對照液濃度吸光度標準曲線（至少5點）擬合回歸方程，求出供試液濃度標準曲線吸收系數(shù)法（不需要對照品） 測定處吸收度，以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算（E值小于100的一般不宜采用）含量 100=鹽酸氯丙嗪含量測定

10、:精密稱取0.2368g，置500ml量瓶中，加鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1ml，置100ml量瓶中，加同一溶劑稀釋至刻度，搖勻，在254nm波長處測得吸收度為0.435，按吸收系數(shù)為915計算，求其百分含量。例子制劑標示量百分含量片劑：g/片區(qū)分注射劑：g/mLV注射 維生素B12注射液規(guī)格為0.1mgm1，含量測定如下：精密量取本品7.5m1，置25ml量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，混勻，置lcm石英池中，以蒸餾水為空白，在3611nm波長處吸收度為0.593，按 為207計算維生素B12按標示量計算的百分含量為例子計算分光光度法 多波長校正計算分光光度法雙波長分光光度法

11、（復方磺胺類藥物的測定）三波長分光光度法（維生素A的測定）導數(shù)光譜法解聯(lián)立方程法比色法 加入適當顯色劑顯色后可見波長處測定酸性染料比色法 （硫酸阿托品片）四氮唑比色法、異煙肼比色法Kober反應法 （甾體激素類藥物）蛋白質(zhì)的雙縮脲反應 （硫酸軟骨素的測定）總黃酮、總生物堿的測定（中藥制劑）測定的是物質(zhì)分子的發(fā)射光譜定量分析：物質(zhì)的低溶液濃度 熒光（發(fā)射光）強度特點：靈敏度高(10-1010-12 g/mL)； 專屬性好 適于低濃度溶液分析（自熄滅） 干擾因素多（空白試驗） 衍生后測定（利血平）熒光分光光度法正比關(guān)系Cx= RxRxbRrRrbCr 藥物的濃度與相應的熒光讀數(shù)之間的線性范圍較窄，

12、故(RxRxb)/(RrRrb)應在0.52測定方法對照品對照法:配制供試品溶液和對照品溶液， 相同條件下測定兩者及其空白的熒光強度測定前，常用基準溶液（硫酸奎寧、藍色熒光）校正儀器靈敏度測定呈原子狀態(tài)的金屬元素和部分非金屬元素定量分析：測定該特征譜線輻射光強度減弱的程度，求出供試品中待測元素的含量特點：靈敏度高、專屬性好測定方法：標準曲線法、標準加入法 原子吸收分光光度法特點：高靈敏度、高專屬性、分析速度快 適用于藥物制劑或復雜樣品高效液相色譜法（HPLC）氣相色譜法（GC） 第四節(jié) 色譜分析法分離分析方法 類 型 特 點HPLCGC分離效能高（理論板數(shù) n）104105填充柱 103毛細管

13、柱=106分析速度快幾分鐘幾十分鐘幾分鐘幾十分鐘靈敏度高 （最小檢出量）UVD 10-9g FD 10-13gTCD 10-8gFID 10-13g適用范圍寬80%有機化合物20%有機化合物儀器化程度高智能化智能化絕大部分藥物固定相、流動相及檢測器的選擇常用系統(tǒng)（反相體系RP-HPLC）固定相：非極性色譜柱流動相：極性溶劑檢測器：紫外吸收檢測器適用于中等極性、弱極性的藥物高效液相色譜法應用情況HPLC法是藥物制劑、多組分樣品分析的首選方法，是各國藥典收載的方法中應用最廣的方法在原料藥的含量測定中，HPLC法主要用于多組分抗生素或生化藥品，或因所含雜質(zhì)干擾測定的化學品種。如：慶大霉素的組分測定，

14、-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等抗生素甾體激素類藥物色譜柱：十八烷基及其他化學鍵合硅膠結(jié)構(gòu)示意圖蒲 公 英 圖分析型色譜柱最常用：C18/ODS、C8內(nèi)徑：4.6mm長度：15mm、25mm柱填料粒度：210mpH：28流動相：極性溶劑 過濾脫氣多元體系緩沖鹽甲醇-水乙腈-水四氫呋喃-水流動相選擇調(diào)洗脫力強弱：四氫呋喃乙腈甲醇水用過緩沖鹽或酸堿流動相后，色譜柱必須用低濃度甲醇溶液沖洗，再用甲醇沖洗例如乙腈（30）乙腈-水(15:15)乙腈-四氫呋喃(15:15)燈 室流通池檢測器 紫外檢測器（UVD 最常用）、二極管陣列（DVD）、以及熒光、電化學、示差折光、蒸發(fā)光散射（ELSD）和質(zhì)譜檢測

15、器（MS）紫外檢測器外觀圖系統(tǒng)適用性試驗 理論板數(shù)（n） 分離度（R） 重復性（RSD） 拖尾因子（T）用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調(diào)整 1）色譜柱的理論板數(shù)（n） n值越大柱效越高，應高于規(guī)定的最小理論板數(shù)tR 保留時間Wh/2 半高峰寬 2）分離度（R） R值越大分離效果越好 在規(guī)定的條件下，注入對照液或供試液，記錄色譜圖，計算待測峰（定量峰）與相鄰峰的分離度，應大于1.5。 = 3）重復性 考察測量的精密度 在規(guī)定條件下，取一定量的對照液，連續(xù)進樣35次，其峰面積測量值的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0。系統(tǒng)的精密度：每次開機后，首先要做的日常工作，不能作為分析方法學研究中的精密度

16、試驗 份號12345A20617.2519663.0719543.3020412.4119254.30 例題 取某對照品溶液10l，連續(xù)進樣5次，記錄各次色譜峰峰面積如下，試判斷色譜系統(tǒng)重復性是否符合規(guī)定。X=19898.1 S=586.789RSD=2.9%不符合規(guī)定 4）拖尾因子（T） 考察色譜峰的對稱性 T 值越接近于1.0 色譜峰的對稱性越好，測量的準確度越高。T應在0.951.05之間。W0.05h為0.05峰高處的峰寬d1為峰極大至峰前沿之間的距離為滿足系統(tǒng)適用性試驗要求，可以改變一些條件，如色譜柱內(nèi)徑、長度、牌號、載體粒度、流動相流速、組成比例、柱溫等，但不能改變固定相種類， 流

17、動相組成和檢測器類型組成復雜、多成分內(nèi)標法需要內(nèi)標物外標法對照品能夠精確進樣量面積歸一化法所有組分都出峰測定方法被測成分與其峰面積成正比關(guān)系要求供試液與對照液濃度相近（相同條件）=A供A對C供對樣品C供=C對A供A對對照 外標法含量計算公式同紫外外標法（標準曲線法） 繪制對照液濃度峰面積(峰高)標準曲線；擬合回歸方程并計算擬合常數(shù)；測定供試品峰面積(峰高)，帶入方程，求濃度。選擇適宜的物質(zhì)作為內(nèi)標物，以待測組分和內(nèi)標物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法稱為內(nèi)標法 內(nèi)標法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標物 校正因子（f ） 其含義為：內(nèi)標物峰面積與其濃度之比（As/Cs）是對照品峰面積與其濃度之比（AR

18、/CR）的多少倍f =As/CsAR/CR 內(nèi)標加校正因子法對照+內(nèi)標樣品+內(nèi)標樣品內(nèi)標對照內(nèi)標C樣 = f A樣/(A內(nèi)/C內(nèi))校正因子f =(A內(nèi)/ C內(nèi))/(A對/C對) 醋酸氫化可的松的含量測定 取對照品適量，精密稱定，加甲醇定量稀釋成每1mL中約含0.35mg的溶液。精密量取該溶液和內(nèi)標溶液（0.30mg/mL炔諾酮甲醇溶液）各5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10L注入液相色譜儀。另取本品適量，同法測定，按內(nèi)標法計算含量。5221345/61228455467824/612584336.2mg35.5mg 100%=97.4%例子已知：對照品取樣36.2mg，樣品取樣35.5mg，測得對照液中醋酸氫化可的松和內(nèi)標的峰面積分別為5467824和6125843，供試液液中兩者的峰面積分別為5221345和6122845特點及區(qū)別：內(nèi)標法使用校正因子，進樣量不影響測定結(jié)果 外標法不使用校正因子，可達一定準確性， 操作條件變化對結(jié)果準確性影響較大 對進樣