代謝物酶法分析技術課件

1、 第五章 代謝物酶法分析技術江蘇大學 鄭鐵生全國高等醫(yī)藥院校醫(yī)學檢驗專業(yè)規(guī)劃教材 臨床生物化學檢驗 （第二版）. 第五章 江蘇大學 鄭鐵生全國高等醫(yī)藥院校醫(yī)學檢驗專業(yè)教學目標與要求掌握：代謝物酶法分析技術的概念，單酶反應直接法、酶促偶聯(lián)法等方法的設計原理，脫氫酶和過氧化物酶指示系統(tǒng)的應用原理，以及平衡法和速率法的設計要求。熟悉：代謝物酶法分析技術的理論基礎，酶循環(huán)法、酶活性恢復法、激活劑和抑制劑測定法的設計原理，平衡法和速率法的優(yōu)缺點。了解：試劑酶的質量要求，以及代謝物酶法分析技術的發(fā)展前景。.2教學目標與要求掌握：代謝物酶法分析技術的概念，單酶反應直接法代謝物酶法分析技術是指用酶法分析的方法

2、來測定人體內的代謝物或代謝產(chǎn)物的技術。 酶法分析（enzymatic method）是以酶為試劑測定酶促反應的底物、輔酶、輔基、激活劑或抑制劑，以及利用酶促反應測定酶活性的一類方法。 代謝物酶法分析技術的概念.3代謝物酶法分析技術是指用酶法分析的方法來測定人體內的代謝物或目錄 代謝物酶法分析的理論基礎1代謝物酶法分析的方法 2代謝物酶法分析的設計要求 3小結與展望4返回總目錄.4目錄 代謝物酶法分析的理論基礎1代謝物酶法分析的方法 2 代謝物酶法分析 平衡法（終點法） 速率法（動力學法） 代謝物酶法分析的理論基礎1.5 代謝物酶法分析 平衡法（終點法）代謝物酶法分析的理論平衡法是指標本中待測物

3、的量有限，經(jīng)過酶促反應逐漸被消耗，當剩余的底物量很?。?%5%）時，指示反應信號逐漸達到平衡，即通常所說的終點，所以又稱為終點法(end-point method)。 平衡法的特點是測定底物的總變化量， 即測定的是“濃度”。平衡法基本理論(1).6平衡法是指標本中待測物的量有限，經(jīng)過酶促反應逐漸被消耗，當剩積分得： 米氏方程 改寫為 式中S0為待測物，St為待測物至反應t時間后的濃度。平衡法基本理論(1).7積分得： 米氏方程 改寫為 式中S0為待測物，St為若反應達到平衡，假設 ，即 S0St S0， 以上積分式： 則可簡化為：說明達到平衡所需的時間與Km、Vmax、S0有關，Km越小、Vm

4、ax越大（加入酶量越多）、S0越?。ù郎y物越少）則達到平衡所需的時間越短。平衡法基本理論(1).8若反應達到平衡，假設 ，即 S0St若 S0 Km 積分得： 可簡化為： 若同時做標準管，不管反應到達何種程度，只要標準管與測定管反應時間（t）一致，則有：平衡法基本理論(1).9若 S0 Km 積分得： 可簡化為： 若同時做標準管 標準管的 S0St 與待測管的 S0St 分別代表消耗量，也代表轉化為產(chǎn)物的量，可以用產(chǎn)物的吸光度來表示（As和Au）。標準管的S0與測定管的S0分別表示為Cs和Cu。可簡化為： 平衡法基本理論(1).10 標準管的 S0St 與待測管的 S0St當 S0St S0，

5、即反應基本達到平衡，Au和As基本穩(wěn)定不變，此時測定誤差最小。如果存在基質效應，兩者反應程度不一，若按上式計算就會帶來誤差。此式是平衡法測定代謝物的基本原理此公式成立是前提條件平衡法基本理論(1).11當 S0St S0，即反應基本達到平衡，A速率法(rate assay)又稱動力學法、連續(xù)監(jiān)測法，測定的是速率（通常指的是初速度），依據(jù)是當?shù)孜锏南牧枯^小時(5%)，酶促反應呈一級反應，此時的反應速度（v）與代測物的濃度成正比例。速率法的關鍵是如何使酶促反應成一級反應。 速率法基本理論(2).12速率法(rate assay)又稱動力學法、連續(xù)監(jiān)測法，測定根據(jù)米氏方程： 當S Km，則S +

6、Km Km當酶量固定不變時，酶促反應的 最大速度Vmax也不變符合一級酶促反應米氏方程改為： 速率法基本理論(2).13根據(jù)米氏方程： 當S Km，則S + Km 若同時帶標準管，則有：標準管的S0與測定管的S0分別表示為Cs和Cu，速度用 A/min來表示。上式改寫為：速率法測定代謝物濃度的原理 前提條件是測定初速度。越偏離初速度，測定誤差則越大。速率法基本理論(2).14若同時帶標準管，則有：標準管的S0與測定管的S0分別在臨床操作中，只要測定期間待測物消耗 5%，只要測定兩個固定時間的吸光度差值，就可以采用標準濃度對照法計算樣本濃度，這種方法又稱為固定時間法(fixed assay)。

7、速率法基本理論(2).15在臨床操作中，只要測定期間待測物消耗 Km2，這時的酶促反應動力學可按單底物法處理，整個反應只與待測物有關，呈一級反應動力學。 但在以NADH 或NADPH 為底物的終點法測定中，因340 nm 吸光度的限制，輔酶的用量不可能過高。 .20雙底物反應直接測定法 對于雙底物反應，為了便于實驗分析，在實在340 nm 處測定吸光度的增加來進行定量的方法乳酸測定雙底物反應直接測定法 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+丙酮酸測定 在340 nm 處測定吸光度的下降來進行定量的方法 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+.21在340 nm 處測定吸光度

8、的增加來進行定量的方法乳酸測定雙酶促反應的底物或產(chǎn)物如果沒有可直接檢測的成分，將反應某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個酶促反應中，從而達到檢測目的的方法稱酶促偶聯(lián)法。 最常用的偶聯(lián)指示系統(tǒng)有兩個：一個是脫氫酶指示系統(tǒng)，另一個為過氧化物酶指示系統(tǒng)。 酶偶聯(lián)法(2).22酶促反應的底物或產(chǎn)物如果沒有可直接檢測的成分，將反應某一產(chǎn)物脫氫酶指示系統(tǒng) 氧化型輔酶NAD(P)+在340 nm 處沒有吸收峰, 還原型輔酶NAD(P)H在340 nm 處有吸收峰.23脫氫酶指示系統(tǒng) 氧化型輔酶NAD(P)+.23脫氫酶指示系統(tǒng) 以脫氫酶為指示酶的系統(tǒng)測定的是氧化型輔酶(NAD+) 或氧化型輔酶(NADP+)變?yōu)檫€原型NAD

9、(P)H后在340 nm 處的吸光度增高來計算出被測物的濃度，也可利用脫氫酶的逆反應，將還原型NAD(P)H 變?yōu)檠趸蚇AD(P)+，測定340 nm 處吸光度的下降來計算被測物的濃度。 .24脫氫酶指示系統(tǒng) 以脫氫酶為指示酶的系統(tǒng)測定的是氧化型輔酶(脫氫酶指示系統(tǒng) 血清葡萄糖己糖激酶法測定 Glu + ATPG-6-P+ADPG-6-P + NADP+P-6-GA + NADPH + H+指示酶反應將NADP+轉化為NADPH + H+，測定340 nm吸光度上升的速度與葡萄糖的含量成正比 .25脫氫酶指示系統(tǒng) 血清葡萄糖己糖激酶法測定 Glu + ATP脫氫酶指示系統(tǒng) 血清尿素測定 尿素

10、 + H2O2NH3 + CO2NH3 + -酮戊二酸 + NADH + H+谷氨酸 + H2O + NAD+測定340nm吸光度下降的速度與尿素的含量成正比，可以用速率法測定；也可以用平衡法測定 .26脫氫酶指示系統(tǒng) 血清尿素測定 尿素 + H2O2NH3 + 常用的試劑酶有乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。體液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、膽汁酸、乳酸、丙酮酸、酮體、乙醇、唾液酸以及氨、鉀、鎂等離子的酶法測定大多使用該指示系統(tǒng)。脫氫酶指示系統(tǒng) .27常用的試劑酶有乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶過氧化物酶指示系統(tǒng) 共用的指示反應最早由Trinde

11、r氏等人提出，被稱為Trinder反應 最大吸收峰為500nm，在可見光范圍內比色。已廣泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、膽固醇、甘油三酯等項目的測定 .28過氧化物酶指示系統(tǒng) 共用的指示反應最早由Trinder氏等人過氧化物酶指示系統(tǒng) 血清總膽固醇氧化酶測定法 膽固醇酯 + H2O膽固醇 + O2膽固醇 + 脂肪酸4-膽甾烯酮 + H2O2紅色醌類化合物H2O2 + 4-AAP + 酚指示酶反應生成的紅色醌類化合物可在500 nm 處比色測定 .29過氧化物酶指示系統(tǒng) 血清總膽固醇氧化酶測定法 膽固醇酯 + 化學名英文縮寫最大吸收峰（nm）酚2，4-二氯酚N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺N

12、-乙基-N-（2-羥基-3-丙磺酰）間甲苯胺N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585過氧化物酶指示系統(tǒng) 常用的Trinder反應生色基團 表內這些酚類衍生物，有的是提高生色基團的穩(wěn)定性和溶解度、產(chǎn)物的靈敏度和穩(wěn)定性；有些生色基團的產(chǎn)物是蘭色醌類，能避免溶血等色素干擾。 .30化學名英文縮寫最大吸收峰（nm）酚P500過氧化物酶指示系統(tǒng)利用底物和輔酶的反復反應，使待測物的酶促反應產(chǎn)物不斷擴增，擴增量決定于循環(huán)次數(shù)，反應產(chǎn)物的增加，提高了檢測靈敏度，減少了共存物質的干擾，達到高靈敏度和特異的要求。 酶循環(huán)法(enzy

13、matic cycling assay)的靈敏度決定于循環(huán)反應速度和時間，循環(huán)反應速度又取決于兩種試劑酶( Ea 和Eb) 的量。該法測定中所選擇酶的Km 值要小，以便用較少的酶量保持所需的靈敏度。 酶循環(huán)法(3).31利用底物和輔酶的反復反應，使待測物的酶促反應產(chǎn)物不斷擴增使用兩種酶，即一種氧化酶用于靶物質的氧化，一種脫氫酶使其回到還原狀態(tài)，促使靶物質(或其衍生物)或靶物質的氧化產(chǎn)物作為底物循環(huán)。檢測指示系統(tǒng)： 循環(huán)前、后用速率法測定NADH(340 nm) 的變化。檢測產(chǎn)物H2O2可通過Trinder 反應比色測定。產(chǎn)物循環(huán)氧化酶脫氫酶系統(tǒng) .32使用兩種酶，即一種氧化酶用于靶物質的氧化，

14、一種脫氫酶使其回到產(chǎn)物循環(huán)氧化酶脫氫酶系統(tǒng) 甘油濃度測定 通過GPO和G-3PDH使G-3P 與DHAP之間循環(huán)，在反復循環(huán)中G-3P 和DHAP 的量不變，而產(chǎn)物H2O2 隨每次循環(huán)不斷遞增，同時NADH 遞減。在規(guī)定時間t 內，H2O2 累計的量決定于t 和每min循環(huán)次數(shù)。 .33產(chǎn)物循環(huán)氧化酶脫氫酶系統(tǒng) 甘油濃度測定 通過GPO和G-底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)用一種脫氫酶和兩種輔酶( thio-NAD+ 和NADH)。用395 nm 415 nm 波長測定反應中氧化型thio-NAD+ 轉為還原型thio-NADH的增加速度。循環(huán)反應條件： 酶對thio-NAD+ 和NADH應有高度親和力

15、。溶液pH 和緩沖體系同時有利于雙向反應。thio-NAD+ 和NADH 二者的濃度和配比達最適條件。 .34底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)用一種脫氫酶和兩種輔酶( thio底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)血淸膽汁酸測定 膽汁酸與3-酮類固醇之間構成循環(huán)，不斷產(chǎn)生硫代還原型輔酶（黃色），控制好條件，反應速度與代測物膽汁酸呈正比。靈敏度可增加數(shù)十倍。 .35底物循環(huán)脫氫酶輔酶系統(tǒng)血淸膽汁酸測定 膽汁酸與3-酮氨循環(huán)合成酶脫氫酶系統(tǒng) NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脫氨-NAD轉化為NAD+，經(jīng)脫氫酶將亮氨酸轉化為氧化異己酸和NH4+同時生成NADH，生成的NH4+進入循環(huán)再次生成NADH，在340nm測

16、定。 .36氨循環(huán)合成酶脫氫酶系統(tǒng) NH4+在NAD合成酶和Mg2+酶循環(huán)法具有的特點 靈敏度隨反應時間的延長而提高靈敏度隨酶在擴增反應中的用量而提高利用酶對底物的特異性,使測定系統(tǒng)簡化利用四唑鹽類的顯色反應可實現(xiàn)比色測定 .37酶循環(huán)法具有的特點 靈敏度隨反應時間的延長而提高.37酶活性恢復法 很多酶必需某些無機離子、微量元素或輔酶存在才發(fā)揮其催化活性。脫去酶中關鍵的無機離子、微量元素或輔酶之后，酶即失去了其催化活性，無活性的酶與標本混合，標本中的無機離子、微量元素或輔酶使該酶重新復活，復活的比例可以反映這些無機離子、微量元素或輔酶的含量。 其他酶法(4).38酶活性恢復法 很多酶必需某些無

17、機離子、微量元素或輔酶存在才發(fā)異檸檬酸脫氫酶法測定血清鎂離子 酶活性恢復法異檸檬酸+ NADP+-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制鈣離子，標本中Mg2+通過恢復ICD 活性，催化異檸檬酸脫氫的正向反應，使NADP+還原，與鎂標準一起在340nm測定吸光度的増加。 .39異檸檬酸脫氫酶法測定血清鎂離子 酶活性恢復法異檸檬酸+ NA酶活性恢復法應用舉例丙酮酸激酶法或色氨酸酶法測定鉀離子-半乳糖苷酶法測定鈉離子淀粉酶法測定氯離子超氧化物歧化酶法測定銅離子碳酸酐酶或堿性磷酸酶法測定鋅離子等 .40酶活性恢復法應用舉例丙酮酸激酶法或色氨酸酶

18、法測定鉀離子.40激活和抑制法 有機磷是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，用標準乙酰膽堿酯酶與標本在37水浴10min，測定剩余的乙酰膽堿酯酶的活性，被抑制的乙酰膽堿酯酶的活性可以計算出標本中有機磷的含量。有機磷的酶法測定根據(jù)酶有否激活劑和抑制劑存在時酶促反應動力學發(fā)生改變來測定激活劑和抑制劑的含量。另有抑制ALP法測定茶堿、激活HK法測定鎂離子等。返回章目錄.41激活和抑制法 有機磷是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，用標準乙酰膽堿酯試劑酶質量試劑酶概念 試劑酶特征 試劑酶純度酶法設計要求 酶法設計共性要求 平衡法設計的要求 速率法設計的要求 代謝物酶法分析的設計要求 3試劑酶來源.42試劑酶質量試劑酶概念 試劑酶

19、特征 試劑酶純度酶法設計要求 酶試劑酶是指作為診斷試劑來測定化合物濃度或酶活性的一類酶。它是酶試劑的核心，它的質量是酶試劑質量的決定性因素。試劑酶的質量要求(1)試劑酶的概念.43試劑酶是指作為診斷試劑來測定化合物濃度或酶活性的一類酶。它是主要來自動植物組織提取及微生物發(fā)酵工程?；蛑亟M酶蛋白也有應用，活力高，雜酶含量少且價格低廉。 不同來源的同一種試劑酶有不同的理化特征。必須掌握專一性和分子量、等電點、Km、最適pH，最適溫度等，并熟悉輔助因子、激活劑和抑制劑對酶活性的影響。 試劑酶的來源和理化特征試劑酶的質量要求(1).44主要來自動植物組織提取及微生物發(fā)酵工程?；蛑亟M酶蛋白也有應不同的

20、酶試劑系統(tǒng)對試劑酶的純度有不同的要求。以NAD(P)H為指示反應中，要求試劑酶有較高的純度。而在Trinder反應中要求相對低一些。 純度主要指標 酶的比活性，酶的比活性越高，酶的純度越高。雜酶含量，容易引起副反應的一些酶含量按 “允許限度”的要求（見表5-2）。 試劑酶的質量要求(1)試劑酶的純度要求.45不同的酶試劑系統(tǒng)對試劑酶的純度有不同的要求。以NAD(P)H表5-2常用試劑酶的理化特征及質量要求 名稱來源分子量等電點比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）葡萄糖氧化酶（GOD）A.nigerp.notatum186 000152 0004.3020蔗糖酶含量0.01%,過氧

21、化氫酶10U/mg蛋白己糖激酶(HK)酵母105 0004.50-4.80140磷酸葡萄糖異構酶0.01%,G-6-P脫氫酶0.01%葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)酵母212 0004.50140己糖激酶、磷酸葡萄糖異構酶0.02%過氧化物酶(POD)辣根40 2007.2050不含胺氧化酶及過氧化氫酶.46表5-2常用試劑酶的理化特征及質量要求 名稱來源分子量等電點名稱來源分子量等電點比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）脲酶巨豆483 0004.905-100天冬氨酸酶0.02%,精氨酸酶0.002%,NH4+0.0005g/U,谷氨酸脫氫酶(GLDH)變形桿菌300

22、 0004.6090醇脫氫酶、乳酶脫氫酶、蘋果酸脫氫酶0.01%乳酸脫氫酶 心135 0004.5-4.8500丙氨酸轉氨酶0.01%,丙酮酸激酶、醛縮酶0.001%脂蛋白脂肪酶（LPL）心，假單胞菌屬47 0005.950.05100ATP酶0.00008%, NADH氧化酶0.001%,膽固醇氧化酶0.002%,過氧化氫酶0.02%甘油激酶（GK)嗜熱脂肪芽胞桿菌209 00085NADH氧化酶0.01%,己糖激酶0.02%.47名稱來源分子量等電點比活性雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）脲名稱來源分子量等電點比活性(U/mg)雜酶占試劑酶活性的%（允許限度）磷酸-3-甘油氧化酶足球菌76

23、0004.60.140乳酸氧化酶0.001%膽固醇酯酶(CEH)假單胞菌302 00025ATP酶0.00008, NADH氧化酶0.001%,GOD0.00001%,尿酸酶0.00004%,過氧化氫酶1U/mg膽固醇氧化酶(CHOD)鏈霉菌34 0005.1-5.425CEH0.005%,GOD0.00014%尿酸酶0.0004%膽紅素氧化酶(BOD)疣胞漆斑菌52 0004.100.2NADH氧化酶0.0007%尿酸酶肝100 0006.3015過氧化氫酶1.0%丙酮酸氧化酶260 0004.301.5ATP酶0.05% ，ALT、AST0.05%.48名稱來源分子量等電點比活性雜酶占試劑

24、酶活性的%磷酸-3-甘油所用試劑酶的特異性：指示酶要有更高特異性； 怎樣消除干擾因素：加消除劑、抑制劑和用雙試劑法；試劑中的附加劑：應不抑制酶的活性，不影響試劑的穩(wěn)定性，不與底物和體液中的物質作用；如何提高靈敏度：用PMS或黃遞酶，將NADH上的氫交給四氮唑鹽，在可見光監(jiān)測； 用酶循環(huán)法； 測定熒光法。酶法分析的設計要求(2)酶法設計的共性要求.49所用試劑酶的特異性：指示酶要有更高特異性； 酶法分析的設計要酶的用量要足夠大，能使反應1 min3 min 達到平衡，以保證較快完成測定。反應要朝正反應方向進行，如果反應的平衡常數(shù)太低，可用增加底物濃度、偶聯(lián)反應移去生成物、改變反應pH 等方法,并

25、設標準管一起到達平衡以后測定。 Km 在保證測定線性的前提下要盡量小。平衡法設計的要求酶法分析的設計要求(2).50酶的用量要足夠大，能使反應1 min3 min 達到平衡，所用酶的 Km 應足夠大，以保證測定線性和較長的反應動態(tài)期。Km 太小，可加入競爭性抑制劑加大 Km。酶用量要合適，用少了可能導致線性期縮短，甚至一級反應喪失。一般認為酶用量比平衡法小。速率法酶促反應受很多因素影響，只有很好控制反應速度（v）才與代測物的濃度成正比例。速率法設計的要求酶法分析的設計要求(2).51所用酶的 Km 應足夠大，以保證測定線性和較長的反應動態(tài)期。區(qū)別速率法平衡法測定時間檢測速度檢測成本產(chǎn)物堆積樣品色原測定儀器較短較快酶用量小，成本低影響較小影響較小要求電噪聲小，A讀準到0.000