淫羊藿苷干預(yù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對NF-κB信號通路表達(dá)的影響課件

1、淫羊藿苷干預(yù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對NF-B信號通路表達(dá)的影響南京市中醫(yī)院骨傷科 錢衛(wèi)慶 立項依據(jù)：國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析 骨關(guān)節(jié)炎是一個世界性骨骼健康問題，嚴(yán)重影響老年人壽命和生活質(zhì)量，目前研究的重心主要基于分析蛋白酶對軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用方面。其中對于淫羊藿苷抑制軟骨破壞，發(fā)揮軟骨保護(hù)的作用已被廣泛認(rèn)可。立項依據(jù)：課題組相關(guān)研究概況我科前期在江蘇省中醫(yī)藥局科技項目及南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項目的資助下我們就淫羊藿苷促成骨形成機(jī)制方面進(jìn)行了相關(guān)的動物及蛋白組學(xué)方面的研究，并圓滿結(jié)題。我科近年來開始就淫羊藿苷對于軟骨細(xì)胞保護(hù)的機(jī)理方面開展探索工作。立項依據(jù)：前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)查閱1.在

2、呼吸系統(tǒng)方面、心血管疾病方面，已有大量試驗發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以抑制NF-B通路的活化，達(dá)到抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)的作用 1-22.在骨科疾病方面，大量研究證實NF-B信號通路與OA形成與發(fā)展具有密切的聯(lián)系。 NF-B首先是由于細(xì)胞外刺激，通過細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致軟骨降解和關(guān)節(jié)損傷 33.穿心蓮內(nèi)酯能夠通過抑制 NF-B 信號通路的激活，顯著地下調(diào) IL-1 刺激人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，降低MMP-3/13 等多種炎性介質(zhì)的表達(dá)4 1 杜文靜；補(bǔ)腎中藥組分淫羊蕾昔對哮喘小鼠嗜酸粒細(xì)胞凋亡的影響d;復(fù)旦大學(xué);2011年 2CHEN SR，XU XZ，WANG YH，et al Icariin Deriva

3、tive Inhibits Inflammation through Suppression of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase and Nuclear Factor-B PathwaysJ Biol Pharm Bull，2010，33( 8) :1307-1313 3. 周莊，張柳等NF-B信號通路在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的研究J中國骨質(zhì)疏松雜志，2012，18( 1) : 78 82 4. Ding QH,JiXW,Cheng Y,et al.inhibition of matrux metalloprteinases and induc

4、ible nitric oxide synthase by andrographolide in human osteoarthritic chondrocytesJ.modRheumatol,2012 Dec 15.立項依據(jù)：前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)查閱4. uPA系統(tǒng)是NF-B的下游調(diào)控因子，NF-KB在炎癥過程中被激活后,進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性, 可上調(diào)uPA的表達(dá)55. uPA和uPAR（uPA受體）在關(guān)節(jié)軟骨病變的表層表達(dá)最為強(qiáng)烈, 并且 uPA和uPAR 的水平與關(guān)節(jié)軟骨破壞的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性 65. MarcuKB，OteroM，OlivottoE，NF一kappaB signal

5、ing:multiple angles to target OA. Curr Drug Targets，2010,11(5): 599一613. 6. 張立智，張先龍，王琦，等 骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨的成骨細(xì)胞生物學(xué)表型研究J 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2011，33( 10) : 1003 1007假設(shè)：淫羊藿苷干預(yù)軟骨細(xì)胞的過程中，淫羊藿苷是否也可以通過抑制NF-B通路的活化，抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)軟骨細(xì)胞作用？同時，在抑制NF-B通路的活化后，是否對下游調(diào)控因子uPA系統(tǒng)產(chǎn)生影響，而進(jìn)一步達(dá)到抑制蛋白酶對軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用？立項依據(jù)：本課題科研假設(shè)立項依據(jù)：前期研

6、究工作基礎(chǔ)我們之前在淫羊藿苷對大鼠成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)影響的研究中發(fā)現(xiàn)10ng.ml-1 濃度的淫羊藿苷能快速促進(jìn)SD大鼠成骨細(xì)胞的增殖和分化7。7.錢衛(wèi)慶，尹宏，孫海濤。不同濃度淫羊藿苷對大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響,中國醫(yī)藥導(dǎo)報2011,36:23-25。研究方案：實驗分組及干預(yù)原代成骨細(xì)胞傳代24小時后分為5組: (1) 空白組: 10%IMDM正常培養(yǎng);(2) PDTC組：加入0.5mmol/LNF-B阻滯劑PDTC (3) 淫羊藿低劑量組:加入0.1mg/mL淫羊藿苷 (4) 淫羊藿中劑量組:加入1mg/mL淫羊藿苷(5) 淫羊藿高劑量組:加入10/mL淫羊藿苷以每孔 1 106個細(xì)胞

7、的密度接種軟骨細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng) 2 h 后，除空白組外均以IL110 gL 1刺激 1 h研究方案：軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 2 周齡新西蘭白兔 3 只，處死，75% 乙醇浸泡; 剪取股骨頭、膝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、肋骨以及劍突處軟骨組織，采用酶消化法原代培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞。型膠原免疫組化染色法兔對軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定 研究方案：淫羊藿苷對NF-B信號通路表達(dá)的影響檢測采用RT-PCR 法檢測MMp3/13 ，uPA，NF-B mRNA 含量 。采用Western blot法檢測 IB（NF-B的抑制蛋白） 、PAI（uPA抑制物）、uPAR （uPA受體）蛋白水平 凝膠阻滯分析實驗檢測 NF-B與 DNA 的結(jié)

8、合活性 。研究方案：技術(shù)路線兔軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)和細(xì)胞活性的鑒定判斷淫羊藿苷對軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)與治療用10 gL 1 的IL一l作用于關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞正?？瞻捉M淫羊藿苷低劑量組:加入0.1mg/mL淫羊藿苷淫羊藿苷中劑量組:加入1mg/mL淫羊藿苷淫羊藿苷高劑量組:加入10/mL淫羊藿苷real一 timePCR技術(shù)檢測MMp3/13 mRNA、uPA mRNA、NF-kb mRNAPDTC組（NF-B阻滯劑）Westen檢測磷酸化的I-B、PAIEMSA檢測NF-B與DNA的結(jié)合本項目的特色與創(chuàng)新1.淫羊藿苷對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其下游的調(diào)控因子uPA系統(tǒng)的影響，目前國內(nèi)外

9、尚未見報道。2.本科題首次在細(xì)胞分子水平上觀察淫羊藿苷對白介素IL1(IL1)誘導(dǎo)下兔軟骨細(xì)胞 NF-KB信號通路及uPA系統(tǒng)的影響，及何種濃度的淫羊藿苷的療效最佳。前期研究：近期發(fā)表與本項目有關(guān)的論著1）錢衛(wèi)慶，尹宏，口服與骨折局部應(yīng)用淫羊藿對骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的影響,中國中西醫(yī)結(jié)合雜志2012年第06期：822-826。 2).尹宏，錢衛(wèi)慶，磷酸鈣骨水泥-淫羊藿復(fù)合材料促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折的愈合,中國組織工程研究2012年第16卷29期：5389-5395。3).尹宏，錢衛(wèi)慶，淫羊藿對骨質(zhì)疏松型骨折局部骨形成蛋白mRNA表達(dá)的影響, 中國骨質(zhì)疏松雜志,2012年18第8期：717-720。 4).錢衛(wèi)慶，尹宏，孫海濤，不同濃度淫羊藿苷對大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化的影響,中國醫(yī)藥導(dǎo)報2