杜仲含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1、杜仲含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化蛋白質(zhì)組學(xué)研究【摘要】目的研究杜仲含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(esenhyalsteells,Ss)向成骨細(xì)胞定向分化過程的蛋白表達(dá)差異，分析杜仲誘導(dǎo)Ss向成骨細(xì)胞分化的可能調(diào)控機(jī)制。方法對(duì)杜仲含藥血清干預(yù)前、干預(yù)后第2天、第7天，第14天的細(xì)胞提取總蛋白，通過雙向電泳別離、PDQuest-7.3.0膠圖分析軟件進(jìn)展分析找出差異蛋白，并進(jìn)展質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫查詢建立功能蛋白質(zhì)組。結(jié)果雙向電泳別離得到641個(gè)蛋白點(diǎn)，選取其中75個(gè)點(diǎn)進(jìn)展質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢得到6個(gè)功能蛋白。結(jié)論實(shí)驗(yàn)認(rèn)為補(bǔ)腎中藥杜仲可能通過上調(diào)波形蛋白、核纖層蛋白A的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分化，下調(diào)

2、鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)，釋放細(xì)胞內(nèi)鈣，參與鈣結(jié)節(jié)的形成，與體內(nèi)骨礦化過程有關(guān)。過氧化物歧化酶、膜聯(lián)蛋白A6與細(xì)胞的活力有關(guān)，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的分裂增殖與分化，但是否與定向成骨細(xì)胞分化有著親密關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究?！娟P(guān)鍵詞】杜仲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳Abstrat:bjetiveTstudytheprtEinhangeinthepressfSsdifferentiatintsteblasguidingbybldseruntainingDuzhngrtexEuiae,anditspssibleregulatinehaniss.ethdsTtalprtEInfellsinterferedbybldse

3、runtainingDuzhngrtexEuiaefr0day,2days,7days,14days,asextrated,runutedbyt-diensinaleletrphresisandsearhedfrdifferentprteinsptbyPDQuest-7.3.0sftarefranalyzinggelpiture.Funtinalprteeasestablishedbyasshratgraphianalysisanddatabasequerying.Results641prteinsptserebtained,hse75sptstreeiveasshratgraphianaly

4、sis,and6funtinalprteinerebtainedbydatabasequerying.nlusinhinesedrugDuzhngrtexEuiaeayup-regulateexpressfvientinandlainAtprteelldifferentiatin,dn-regulateexpressfalretiulintreleaseintraellulara2+hihisrelatedta-ndusandbneineralizatininbdies.SDandannexinA6arenernedithrpusularvigr,regulaterpusulardivisin

5、grthanddifferentiatin,buthethertheyhaveintiaterelatinithdiretinaldifferentiatinfrSststeblastisunknn,aitingfrfurtherresearh.Keyrds:DuzhngrtexEuiae；Ss；Prtee；T-diensinaleletrphresis骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Ss是一種多功能干細(xì)胞，在不同條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等分化。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，主骨，生髓，經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲含藥血清可以誘導(dǎo)Ss向成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)細(xì)胞增殖，但對(duì)于Ss向成骨細(xì)胞分化這一復(fù)雜過程的機(jī)制缺乏相關(guān)

6、研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究是后基因組學(xué)時(shí)代又一重要研究工具，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。本文建立補(bǔ)腎中藥杜仲含藥血清干預(yù)Ss體外定向分化為成骨細(xì)胞過程，采用蛋白組學(xué)技術(shù)分析Ss分化過程中不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)的變化情況，從蛋白質(zhì)分子程度上解釋杜仲干預(yù)Ss分化的可能機(jī)理。1器材1.1動(dòng)物SPFSD大鼠2只，體質(zhì)量150200g，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2試劑L-DE培養(yǎng)基、南美洲胎牛血清FBS、海克隆，杜仲產(chǎn)地云南，0.25%胰酶GIB公司，礦物油、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、HAPS、DTT、Indaetaidesiga，尿素BBI，硫脲天津市化學(xué)試劑一廠，PH3-10兩性電解質(zhì)Bi-Rad，

7、考馬斯亮藍(lán)(G2250、R2250)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、苯甲基磺酰氟(PSF)、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍(lán)、甘油、無水碳酸鈉、硫代硫酸鈉、三氟乙酸(TFA)、無水甲醇、無水乙醇、冰醋酸為國產(chǎn)分析純，購于廣州威佳公司。1.3器材25，75，1752培養(yǎng)瓶ning，酶標(biāo)儀Ther，2培養(yǎng)箱(Heraeus)，注射器針頭濾器，0.22濾膜ILLIpre，SIGA-3K15離心機(jī)siga，雙向電泳儀器：ultiphrIIAersha、PrteanIIxiellBi-Rad，IPG固相膠條17，PH：3-10，Bi-Rad，PDQuest凝

8、膠分析軟件(7.3.0版本)(美國Bi-Rad公司)、Perlk2100XL凝膠圖像掃描儀(美國UAX公司)、質(zhì)譜儀器4700prteisAnalyzerABI公司，超低溫冰箱SANY。2方法2.1杜仲含藥血清的制備取杜仲藥材粗粉150g，加70%乙醇10倍量，加熱回流兩次，1h/次，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至300l，室溫冷卻，4冰箱保存?zhèn)溆谩⒅兴幩幰合♂屩?.3g生藥/l灌胃，1l/次，2次/d，連續(xù)給藥4d，最后一次給藥后1h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置3h后置4冰箱過夜，2500r/in離心20in，搜集上清液，針頭濾器過濾除菌，置-20保存?zhèn)溆谩?.2Ss別離、純化、擴(kuò)增、誘導(dǎo)SD

9、大鼠以10%水合氯醛0.7l經(jīng)腹腔麻醉后，75%酒精浸泡頸部以下軀體5in，無菌條件下取出雙下肢股骨和脛骨，修潔軟組織后，咬骨鉗修剪骨端，暴露髓腔，10l注射器汲取含10%胎牛血清的L-DE培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔，至到骨質(zhì)外觀微微透亮。252培養(yǎng)瓶搜集骨髓沖洗液，放37、5%2孵箱培養(yǎng)，每3天換液1次。當(dāng)原代長滿瓶底90%以上時(shí)0.25%胰酶消化后11傳代至752培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞長滿752培養(yǎng)瓶時(shí)，以0.25%胰酶消化后12傳代至長滿4瓶752培養(yǎng)瓶，再以11傳代至1752培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底80%時(shí)其中3瓶參加含10%杜仲血清的L-DE，余下的一瓶細(xì)胞立即0.25%胰酶消化后搜集細(xì)胞，并分別于誘

10、導(dǎo)后第2天、第7天、第14天同法搜集細(xì)胞，置-80保存?zhèn)溆谩?.3細(xì)胞總蛋白的提取及定量細(xì)胞解凍后用10l/LTris/250l/LSrirsepH7.0洗滌3次，參加2l裂解液8l/L尿素，4%/VHAPS，65l/LDTT，2%PHaralyte-10混勻，加50g/lRNase及200g/lDnase，在4放置15in，再14000r/in，4離心30in，上清bradfrd法測(cè)濃度，-80保存。2.4第1向等電聚焦從冰箱中取出IPG預(yù)制膠條，用溶脹緩沖液8l/L尿素，2l/L硫脲，0.5HAPS,0.52%兩性電解質(zhì)，0.02溴酚藍(lán)，1DTT將膠條泡脹12h。將膠條取出放入聚焦槽內(nèi)，參

11、加礦物油至沒過上樣杯，上樣量為0.6g，并用溶脹buffer稀釋至190l。對(duì)好正、負(fù)極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序表1。聚焦完畢的膠條，立即進(jìn)展平衡，第2向SDS電泳。表1等電聚焦程序略2.5膠條平衡將膠條放入平衡緩沖液I50l/LTris-Hl6.8，6l/L尿素，30甘油，2%SDS，2DTT，0.02溴酚藍(lán)程度振蕩15in，再將膠條轉(zhuǎn)入平衡緩沖液II50l/LTris-Hl6.8，6l/L尿素，30甘油，2%SDS，2.5IAA，0.02溴酚藍(lán)程度振蕩15in。2.6第2向聚丙烯酰胺凝膠SDS電泳膠條平衡之前配制丙烯酰胺凝膠4塊，別離膠濃度為12%配制如表2。表2聚丙烯酰胺凝膠的配置略

12、第2次平衡完畢后，將IPG膠條從樣品水化盤中移出，放到已配好的SDS凝膠上端，并將arker分子量為97，66，45，30，20.1和14.4kDa放到凝膠的一端，再用0.5的瓊脂糖將膠條和arker封嚴(yán)，切忌不能產(chǎn)生氣泡。并將膠板固定于電泳槽內(nèi)。向電泳槽參加電泳緩沖液后，接通電源，100V恒壓電泳至溴酚藍(lán)條帶全部進(jìn)入別離膠后調(diào)電壓至120150V恒壓電泳56h，待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部邊緣時(shí)即可停頓電泳。電泳完畢后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，進(jìn)展染色。2.7考馬斯亮藍(lán)染色將凝膠放入裝有染色液10硫酸銨，10磷酸，0.12G250，20甲醇的程度盤內(nèi)，并將程度盤置程度搖床上程度振蕩過夜。搜集染

13、色液，將凝膠浸于脫色液3冰醋酸溶液中，程度搖床振蕩。最后換成Q再洗滌30in。2.8圖像分析及蛋白鑒定圖像分析及蛋白鑒定：染色后的凝膠用水洗凈后，采用掃描儀進(jìn)展掃描成像，掃描分辨率設(shè)為300dpi?？既緢D像分析采用PDQuest軟件(Bi-Rad)進(jìn)展分析；分析過程包括點(diǎn)檢測(cè)和編輯、建立和編輯比擬組、比擬組的數(shù)據(jù)分析及點(diǎn)的計(jì)數(shù)和解釋等，詳細(xì)方法參照軟件操作說明進(jìn)展。通過對(duì)分析膠的比照分析，可以找出比擬組中表達(dá)呈現(xiàn)差異的蛋白點(diǎn)，這些差異蛋白點(diǎn)在考染凝膠中的對(duì)應(yīng)蛋白斑點(diǎn)將作為質(zhì)譜分析對(duì)象。對(duì)目的蛋白點(diǎn)進(jìn)展胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3l肽段提取液，與等體積-氰基-4-羥基肉桂酸飽和的0.1

14、TFA/50乙腈溶液混合后點(diǎn)于質(zhì)譜儀的96孔不銹鋼靶上。按照說明進(jìn)展操作。3結(jié)果經(jīng)bradfrd法測(cè)定各組總蛋白濃度分別為0d3.24g/l，2d4.10g/l，7d4.7g/l，14d7.27g/l。說明杜仲含藥血清可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。整個(gè)圖譜來分析，點(diǎn)與點(diǎn)之間區(qū)分比擬明顯，可以對(duì)其進(jìn)展蛋白質(zhì)表達(dá)的差異分析。采用PDQuest-7.3.0膠圖分析軟件進(jìn)展軟件分析，找出差異蛋白點(diǎn)共641個(gè)，選取其中75個(gè)點(diǎn)行質(zhì)譜分析并進(jìn)展數(shù)據(jù)庫查詢。其中6個(gè)點(diǎn)具有積極意義。見圖14。PDQuest-7.3.0膠圖分析軟件分析結(jié)果，各蛋白點(diǎn)表達(dá)量見表3。表3各蛋白點(diǎn)表達(dá)量略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.對(duì)差異點(diǎn)進(jìn)展ALD

15、I-TF分析，得到各自的肽質(zhì)量圖譜見圖510。從圖譜中可見，各肽質(zhì)量指紋圖譜信號(hào)較強(qiáng)，基線平穩(wěn)，合適進(jìn)一步數(shù)據(jù)庫檢索鑒定。根據(jù)得到各肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)，及分子量范圍和其他相關(guān)數(shù)據(jù)，通過NBInr網(wǎng)站查詢與之相匹配的蛋白，搜素結(jié)果見表4。表4各點(diǎn)蛋白信息略F18為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1，本研究中發(fā)現(xiàn)隨著杜仲含藥血清對(duì)Ss的誘導(dǎo)，SDF-1表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，第14天時(shí)不能檢測(cè)出，在杜仲含藥血清誘導(dǎo)Ss向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該時(shí)期Ss已分化為成骨細(xì)胞，故不在表達(dá)SDF-1。說明基質(zhì)細(xì)胞衍生因子表達(dá)于Ss，而不表達(dá)于成骨細(xì)胞中，可作為檢測(cè)Ss分化程度的標(biāo)志。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高度表達(dá)SDF-1可能

16、是將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為造血干細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)展培養(yǎng)獲得成功1的機(jī)制。骨髓造血干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均屬于骨髓來源干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的SDF-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能趨化D+34細(xì)胞的細(xì)胞因子，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D+34造血干細(xì)胞可根據(jù)SDF-1的濃度遷移。有些報(bào)道SDF-1也具有刺激活性，增加造血干細(xì)胞的增殖分化2，但是也有研究認(rèn)為SDF-1僅具有趨化活性，SDF-1能刺激VEGF在造血中發(fā)揮作用3。目前在骨組織工程的種子細(xì)胞主要骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞，而組織工程需要足夠的細(xì)胞，由實(shí)驗(yàn)可以看出，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞移植，可以比成骨細(xì)胞更多的聚集造血干細(xì)胞，造血干細(xì)胞具有分化

17、為血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能4,5，能改善部分缺血狀態(tài)，更能到達(dá)組織工程的要求，如將兩者作為共育體移植將對(duì)骨缺血壞死的治療提供新的思路。G21是超氧化物歧化酶SD，屬于金屬酶，是一種主要的抗氧化酶，能去除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及預(yù)防衰老等方面起著重要作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著Ss向成骨細(xì)胞分化，該酶的表達(dá)逐漸減少，細(xì)胞出現(xiàn)衰老趨勢(shì)或凋亡。Ss作為原始細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖才能和在條件誘導(dǎo)作用下分化的才能，高度表達(dá)SD；而體細(xì)胞成骨細(xì)胞無再分化才能，隨著Ss向體細(xì)胞的分化，細(xì)胞活力呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，與SD表達(dá)下調(diào)有著親密關(guān)系。E17為鈣網(wǎng)織蛋白R(shí)T，是1974年命名的骨骼肌

18、肌質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣結(jié)合蛋白。結(jié)合鈣的才能極強(qiáng)，參與鈣的貯藏和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；細(xì)胞黏附；基因表達(dá)的調(diào)控等。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣網(wǎng)織蛋白含量下降時(shí)，鈣從細(xì)胞中釋放出，當(dāng)細(xì)胞RT過表達(dá)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)a2+儲(chǔ)量增多，a2+升高，SERA拮抗劑thapsigargin誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)a2+釋放增多6；此時(shí)細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著Ss向成骨細(xì)胞分化，鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)出逐漸下調(diào)的趨勢(shì)，當(dāng)成骨誘導(dǎo)20天后，鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色陽性，推測(cè)該蛋白與鈣結(jié)節(jié)的形成有親密關(guān)系，在體內(nèi)參與骨礦化過程。E4為波形蛋白(vientin)，是間充質(zhì)來源細(xì)胞的中間纖維蛋白，附在細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體的旁邊或末端，因此相信波形蛋白在支撐及錨

19、固原生質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器有著重要的角色。它亦能維持細(xì)胞的形狀、細(xì)胞質(zhì)的完好性及穩(wěn)定細(xì)胞骨架內(nèi)的互相作用。在試驗(yàn)誘導(dǎo)初期，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈增生性變化，該蛋白表達(dá)量逐漸升高，后期向成骨細(xì)胞分化后，細(xì)胞增殖減慢，該表達(dá)量呈減低趨勢(shì)。F6為核纖層蛋白AlainA，與波形蛋白同屬于中間纖維蛋白的一種，是所有真核細(xì)胞核構(gòu)造所必需的構(gòu)造蛋白7，主要參與構(gòu)成核的功能8，在核形成過程中起著重要作用9。兩者與細(xì)胞分化有親密關(guān)系。在分化實(shí)驗(yàn)中，Ss誘導(dǎo)前沒有檢測(cè)出該蛋白，說明此時(shí)Ss尚處于增殖狀態(tài)；當(dāng)向Ss的培養(yǎng)液中參加杜仲含藥血清后2d后細(xì)胞開場(chǎng)表達(dá)該蛋白，說明Ss開場(chǎng)分化。在杜仲含藥血清干預(yù)過程中，呈現(xiàn)出逐漸上調(diào)的

20、趨勢(shì)，至第7天達(dá)頂峰，14d后逐漸下降。結(jié)果說明杜仲含藥血清可以促進(jìn)Ss的分化過程。F3為膜聯(lián)蛋白A6annexinA6，膜聯(lián)蛋白annexins是一類構(gòu)造相關(guān)鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族，約占細(xì)胞總蛋白的2。在細(xì)胞中參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜外表一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動(dòng)，包括囊泡運(yùn)輸、胞吐作用中的膜交融、信號(hào)傳導(dǎo)和鈣離子通道的形成、調(diào)控炎癥反響、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架蛋白間的互相作用等。每種annexin蛋白在機(jī)體的不同組織和部位執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能，但是，每種annexin確切的生理功能尚不非常清楚。認(rèn)為annexinI參與了膜的聚集、參與調(diào)控APK/ERK與PLA2介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、及在腫瘤細(xì)胞的增殖與

21、分化、甚至細(xì)胞凋亡等生理過程中起重要作用。從本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著Ss向成骨細(xì)胞分化，annexinA6的表達(dá)逐步升高，可以推斷該蛋白可能具有促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖的作用。4結(jié)論Ss向成骨細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，其機(jī)制還不明確，實(shí)驗(yàn)認(rèn)為杜仲可能通過上調(diào)波形蛋白、核纖層蛋白A的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞分化，下調(diào)鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)，釋放細(xì)胞內(nèi)鈣，參與鈣結(jié)節(jié)的形成，與體內(nèi)骨礦化過程有關(guān)。過氧化物歧化酶、與膜聯(lián)蛋白A6與細(xì)胞的活力有關(guān)，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的分裂增殖與分化，但是否與定向成骨細(xì)胞分化有著親密關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在早期高度表達(dá)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能趨化D34+細(xì)胞的細(xì)胞因子

22、，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D34+造血干細(xì)胞可根據(jù)SDF-1的濃度遷移。有些報(bào)道SDF-1也具有刺激活性，增加造血干細(xì)胞的增殖分化，但是也有研究認(rèn)為SDF-1僅具有趨化活性，SDF-1能刺激VEGF在造血中發(fā)揮作用。造血干細(xì)胞表達(dá)D34+，在D34+參與下，HS持續(xù)表達(dá)G蛋白耦聯(lián)受體(GprtEinupledereeptrs,GPRs),XR4，ysLT1，S1P，S1P1等,促使細(xì)胞發(fā)生趨化、粘附從而引起HS的遷移和聚集；證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞有可能在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)及共同移植。【參考文獻(xiàn)】1YinH,angX,KiSS,etal.Transplantatinfintatratgnadsusingvasularanastsis:effetsfrypreservatin,ishaeiaandgentypeJ.HuReprd,2022,18(6):1