藥物化驗實驗重要的實驗方法

1、- - -重要的實驗方法一、液體化合物的分離與提純方法有機合成產生的液體化合物其分離純化一般采用蒸餾的方法。根據待分離組分和理化性性質的不同，蒸餾可以分為簡單蒸餾和精餾（分餾） ； 根據裝置系統(tǒng)內的壓力不同又可分為常壓和減壓蒸餾。對于沸點差極小的組分分離或對產物純度要求極高的分離，則可應用高真空技術。參見有機化學實驗。二、固體化合物的提純方法化學合成藥物的純度和質量是關系到人身安危的重大問題。為了獲得高純度的藥品，對最終成品及關鍵中間體必須進行提純和精制。固體物質一般采用結晶（重結晶、分級結晶等）或升華的方法進行純化。參見有機化學實驗。三、常用色譜方法色譜（又稱層析）是一種物理的分離方法。它的

2、分離原理是使混合物中各組分在兩相間進行分配，其中一相是不動的，稱為固定相，另一相是攜帶混合物流過此固定相的流體，稱為流動相。當流動相中所含混合物經過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用。由于各組分在性質和結構上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小、強弱也有差異，因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。這種借助在兩相間分配差異而使混合物中各組分分離的技術，稱為色譜法。（一）薄層色譜薄層色譜（TLC）是一種簡單實用的實驗技術，屬固液層析。一般薄層色譜的固定相是硅膠或氧化鋁，屬吸附層析。在層析過程中，吸附劑對樣品中各組分的吸附力不同，當展開劑流過時，各組

3、分被展開劑從吸附劑上解析下來的難易程度不同，從而造成各組分移動時的速度差別，而達到分離的目的。薄層色譜可以用來分離混合物、鑒定精制化合物、測量混合物中各組分的含量、測定樣品純度。其展開時間短，幾十分鐘就能達到分離目的，分離效率高，還可用制備板分離幾毫克到幾百毫克的樣品。在藥物合成實驗中，還常用來跟蹤反應進程和確定反應的終點。薄層色譜特別適用于揮發(fā)性小的化合物以及在高溫下化學性質不穩(wěn)定的化合物的分析。（二）柱層析色譜柱層析色譜是通過層析柱來實現分離的，主要用于大量化合物的分離。層析柱內裝有固體吸附劑，也就是固定相，如氧化鋁或硅膠等。液體樣品從柱頂加入，在柱的頂部被吸附劑吸附，然后從柱的頂部加入有

4、機溶劑也就是展開劑進行洗脫。由于吸附劑對各組分的吸附能力不同，各組分以不同速度下移，被吸附較弱的組分在流動相里的含量較高，以較快的速度下移。各組分隨溶劑按一定順序從層析柱下端流處，分段收集流出液，再用薄層色譜來鑒定各組分。柱層析的分離條件可以套用該樣品的薄層色譜條件，分離效果亦相同。（三）紙層析色譜紙層析是以濾紙為載體，用一定的溶劑系統(tǒng)展開而達到分離、分析目的的層析方法。此法可用于定性，亦可用于分離制備微量樣品。紙層析的原理是分配層析。濾紙是載體，水為固定相，展開劑為流動相。試樣在固定相水與流動相展開劑之間連續(xù)抽提，依靠溶質在兩相間的分配系數不同而達到分離的目的。物質在兩相之間有固定的分配系數

5、，在紙層析色譜上也有固定的比移值。紙層析色譜法的一般操作時，將待試樣品溶于適當溶劑，點樣于濾紙一端，另用適當挑選的溶劑系統(tǒng)，從點樣的一端通過毛細現象向另一端展開。展開完畢，濾紙取出陰干，以適當顯色劑顯色，即得紙層析色譜。樣品層析往往用比移值Rf 來表示某一化合物在紙層析色譜中的位置。（四）高效液相色譜高效液相色譜（HPLC）是一種具有高靈敏度、高選擇性的高效、快速分離分析技術，廣泛應用于醫(yī)藥分析的各個領域。在藥品質量控制如主要成分的定性定量分析、雜質的限量檢查和測定、穩(wěn)定性考察等、藥物合成反應的監(jiān)測、藥物體內過程和代謝動力學研究、中藥的成分研究及人體內源活性物質的測定中，HPLC 都是重要的分

6、析手段。例如，伊腎上腺素受體拮抗劑類藥物均為手性分子的外消旋體，其對映異構體的藥效學差異顯著。近年來在這些藥物的對映體選擇性HPLC 分析方法研究上取得了令人矚目的進展。常見的HPLC 手性拆分方法有手性固定相直接拆分法、手性試劑衍生化法和手性流動相添加法。例如，采用柱前衍生化測定普萘洛爾對映體：色譜條件：色譜柱：Micro Pak SP C8 柱（15 mmx 14 mm）流動相：醋酸鈉（0.02 mol / L ， pH 4.0）乙腈（30:70）流速： 2 mL / min檢測：熒光，265 nm / 345nm。樣品測定：樣品經硼酸-磷酸二氫鈉緩沖液（ 0.10 mol / L ， p

7、H 用氫氧化鈉調至8.5） 稀釋，混合后取樣品溶液 20山，加入（+）-1- （9-藥基）-乙基甲酰氯（FLEC）衍生化試齊IJ 20 L, 反應10 min后，取10山進樣。保留時間：（-）-普蔡洛爾衍生物為 6.549 min； （+）-普秦 洛爾衍生物為7.070 min； FLEC 為 12.1 min。四、光學異構藥物的拆分藥物的立體結構與生物活性密切相關。含手性中心的藥物，其對映體之間的生物活性往往有很大的差異。研究表明藥物立體異構體藥效差異的主要原因是他們與受體結合的差異。近年來人們對光學異構體間的藥效有了長足的認識，以單一異構體供藥用已引起各方面的重視，今后的新藥研制將日益朝著

8、單一對應體藥物的方向發(fā)展。對應異構體的藥物一般可以通過不對稱合成或拆分方法得到。然而就目前醫(yī)藥工業(yè)生產而言，尚未有成熟的不對稱合成方法用于藥物的大量生產，因此，拆分仍然是獲得手性藥物的重要方法。常用的光學異構藥物的拆分方法與拆分原理包括：（一）播種結晶法在外消旋體的飽和溶液中加入其中一種純的單一光學異構體（左旋或右旋）結晶，使溶液對這種異構體成過飽和狀態(tài)，然后在一定溫度下該過飽和的旋光異構體優(yōu)先大量析出結晶，迅速過濾得到單一光學異構體。再往濾液中加入一定量的消旋體，則溶液中另一種異構體達到飽和，經冷卻過濾后得到另一個單一光學異構體，經過如此反復操作，連續(xù)拆分便可以交叉獲得左旋體和右旋體。播種結

9、晶法的優(yōu)點是不需用光學拆分劑，因此原料消耗少、成本低。而且該法操作較簡單、所需設備少、生產周期短、母液可套用多次、拆分收率高。但該法僅適用于兩種對映體晶體獨立存在的外消旋混合物的拆分，對大部分只含一個手性碳原子的互為對映體的光學異構藥物，無法用播種結晶法進行拆分。另外，播種結晶法拆分的條件控制也較麻煩，制備 過飽和溶液的溫度和冷卻析晶的溫度都必須通過實驗加以確定，拆分所得的光學異構體的 光學純度不高。 （二）形成非對映異構鹽法 對映異構體一般都具有相同的理化性質，用重結晶、分餾、萃取及常規(guī)色譜法不能分離。 而非對映異構體的理化性質有一定差異，因此利用消旋體的化學性質，使其與某一光學活 性化合物（即拆分劑）作用生成兩種非對映異構鹽，再利用它們的物理性質（如溶解度） 不同，將他們分離，最后除去拆分劑，便可以得到光學純的異構體。目前國內外大部