熒光輻射機理

1、1光致電子轉移(PET)遞給熒光基團的鍵合基團(RecePtor)，負責光吸收并產生熒光發(fā) 射信號的熒光基團(Fluorophorc)其熒光發(fā)射強度反映鍵合基團的結 合狀態(tài)，以及連接鍵合集團和熒光基團的連接基團(Spacer)o鍵合基 團和熒光基團通常為電子給體或者電子受體。光致電子轉移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電 子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉移從而導致熒光的淬滅過程。例 如，當熒光分子傳感器的鍵合基團是電子給體，熒光基團是電子受體 時，具體PET作過程如下:在光激發(fā)下，具有電子給予能力的鍵合基 團能夠將其處于最高能級的電子轉入激發(fā)態(tài)下熒光基團空出的電子 軌道，使被光激發(fā)的電

2、子無法直接躍遷巨到原基態(tài)軌道發(fā)射熒光， 從而導致熒光的淬滅；當鍵合基團與底物結合后，降低了鍵合基團的 給電子能力，抑制了 PET過程，熒光基團中被光激發(fā)的電子可以直 接躍遷回到原基態(tài)軌道，從而增強了的熒光基團的熒光發(fā)射。因此在 未結合底物前，傳感器分子表現(xiàn)為熒光淬滅，一旦鍵合基團與底物相 結合，熒光基團就會發(fā)射熒光(見圖)由于與客底物結合前后的熒光強度差別很大，呈現(xiàn)明顯的“關”、“開” 狀態(tài)，因此這類熒光化學傳感器又被稱為熒光分子開關。PET熒光分 子傳感器的作用機制可由前線軌道理論“來進一步說明(見圖1.5)。ICT熒光化學傳感器由推電子基團、吸電子基團通過p電子體系連接 而成，在基態(tài)時表現(xiàn)

3、為極化結構，一端為缺電子部分，另一端為富電子部分;而在光激發(fā)下，偶極矩增大，強化了這種極化特征，容易發(fā)生ICT過程（如圖）。A +cKLlmrt dondilmgpsiilp-systemckilruni wuhUra 訕 H穿U 4-1kvG -donuliing pjirtp-sternkclrom wiiihdrf ing;一* 圖】尚分r內電荷轉移的產生原理thiojesccnccICT熒光化學傳感器的工作原理有兩種（見圖l.7a）:當?shù)孜锸侨彪娮踊?團（陽離子）時，一種是底物與吸電子基團結合，將增大分子內電荷轉 移程度，導致熒光光譜紅移;一種是底物與推電子基團結合，則使原 來向共扼體

4、系轉移的孤對電子用于與陽離子形成配位鍵，導致ICT 推一拉電子的特征下降，導致熒光光譜藍移。當?shù)孜锸歉浑娮踊鶊F（陰 離子）時，情況相反。一般情況下，ICT熒光化學傳感器對熒光強度 的影響不如PET熒光化學傳感器顯著。典型例子是同時含有吸電子取代基、推電子取代基的電子體系，如氨基鄰苯二甲酞亞胺、二苯基 烯、氟代香豆素等。ICT熒光化學傳感器的缺點是對外部環(huán)境的變化 十分敏感，有較強的溶劑化效應。(b) reaction coordinaie(a) reaction coordinate(b) reaction coordinaie(a) reaction coordinate圖1.7以分子內共輒

5、的電荷轉秒化合物為槌颶器的筮花部件時，其工作花況的勢能圖說明I在ICT中，有一種情況被稱為扭曲的分子內電荷轉移(TICT twisted Intramolecular charge transfer)。在具有推一拉電子共扼體系的熒光分 子中，如果推電子基(如二甲氨基)通過可旋轉的單鍵與熒光團相連 接，當熒光團被光子激發(fā)時，由于強烈的分子內光致電荷轉移，導致 原來與芳環(huán)共平面的電子給體繞單鍵旋轉，而與芳環(huán)平面處于正交狀 態(tài)，原來的共轆系統(tǒng)被破壞，部分電荷轉移變?yōu)橥耆碾娮愚D移，形 成TICT激發(fā)態(tài)(見圖)。當形成TICT激發(fā)態(tài)時，原有的ICT熒光則 被淬滅。TICT態(tài)常常不發(fā)射熒光或者發(fā)射弱的長

6、波熒光，少數(shù)情況 下會出現(xiàn)ICT與TICT雙重熒光現(xiàn)象。3熒光共振能量轉移(FRET)FRET熒光傳感器分子的組成與其他類型傳感器有所不同，除了含有鍵合基團(Receptor)彩!連接基團(Spacer),還含有兩個負責光吸收井產 生熒光發(fā)射信號熒光基團(FluoroPhore),而這兩個熒光基團一個是能 量給體(Energy donor， D)，另一個是能量受體(Energy acceptor， A)。 熒光共振能量轉移是指在一定波長的光激發(fā)下，熒光基團中的能量給 體(D)產生熒光發(fā)射，并通過偶極一偶極之間的相互作用把能量無輻 射地轉移給其附近的處于基態(tài)的能量受體(人)熒光基團的過程。FRE

7、T 過程的發(fā)生與很多因素如光譜重疊的程度、躍遷偶極的相對方向，給 體)和受體0)之間的距離等有關。首先，能量給體)的發(fā)射光譜 與能量受體(A)的吸收光譜有明顯的重疊，能量受體必須能夠在能量 給體的發(fā)射波長處吸收能量，但能量受體可以是熒光發(fā)射基團，也可 以是熒光淬滅基團。對于前一種情形，激發(fā)能量給體時，可以觀察到 能量受體的熒光發(fā)射;而后一種情形，只能觀察到能量給體的熒光變 化。其次，能量給休與能量受休相隔的距離必須遠大于它們之間的碰 撞直徑(有時甚至相距遠達70-100A)時，才可能發(fā)生能量給體與能量 受體的非輻射能量轉移，又稱為長距離能量轉移。另外，能量給休(。) 與能量受體(A)還必須以適

8、當?shù)姆绞脚帕?。利用FRET效率對距離的 強的依賴性，F(xiàn)RET廣泛應用于蛋白質和核酸的結構及動力學研究、 分子結合的測定等領域。例如，當熒光分子傳感器的兩個熒光基團都是熒光發(fā)射基團時，具體 FRET工作過程如下(見圖1.8):在光激發(fā)下，熒光基團中的能量給休(D) 產生熒光發(fā)射;傳感器分子通過鍵合基團鍵合底物來調節(jié)能量給體(D) 和能量受體(A)之間的距離以及排列方向。如果底物的加入使這些因素均在適當范圍，能量給體)可將能量通過非輻射轉移給能量受體 (A),表現(xiàn)為能量受體(A)的熒光發(fā)射;如果底物的加入使這些因素與 FRET因素不能匹配，則會抑制FRET過程，則表現(xiàn)為能量給體(。) 的熒光發(fā)射(

9、圖)。4 激基締/ 復合物(exeimer/exciplex)基于激基締/復合物(excimer/exciplex)的熒光化學傳感器分子的 特點是在一個分子中含有兩個熒光基團，如多環(huán)芳烴蔡、蒽和花等， 并且兩個基團處于分子的合適位置。當兩個熒光基團相同時，其中一 個熒光基團(單體)被激發(fā)后，會和另一個處于基態(tài)的熒光基團形成分 子內激基締合物(excimer)。激基締合物的熒光發(fā)射光譜取代了單體的 發(fā)射峰，呈現(xiàn)出一個新的強而寬的、長波長的、無精細結構的熒光發(fā) 射峰。當兩個熒光基團不同時，則稱之為激基復合物(exciplex)。激基 締/復合物形成與否的關鍵是兩個熒光基團之間的距離，只有激發(fā)態(tài)分子

10、與基態(tài)分子之間的距離約為3.5A時，才能形成激基締/復合物?；诩せ?復合物(excimer/exciplex)的熒光化學傳感器就是利 用受體結合底物后導致激基締/復合物構型的形成或破壞，使激基締/ 復合物的熒光增強或消失，通過單體、激基締/復合物的熒光光譜變 化表達底物識別的信息。因此，構型的變化是此類信息產生的原因， 圖給出了加入底物后可以形成激基締合物的熒光化學傳感器的工作 原理。蔡、花、蒽等熒光團由于具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命，容易形 成激基締/復合物，常常被用于此類熒光化學傳感器中。monomer exciBueremission due lo proximity the【理fluo

11、rophorcsmonomer emission.signalingbindingRyhilindl5；ite圖.9基于激基締合物的芝出學傳感器的工作原理雜原子對熒光的影響比較復雜，有時增強熒光，有時減弱熒光。主要 看雜原子化合物的結構。簡單雜環(huán)化合物的熒光量子產率很小，幾乎 為0，但當他們與苯環(huán)相并后的產物熒光大大增強。含氮雜環(huán)化合物 的分子中含有N原子。在非極性介質中它們的熒光很弱，隨著介質 極性的提高，其熒光強度亦隨之提高。取代基的影響取代基的性質對熒光體的熒光特性和強度均有強烈影響，芳烴和雜環(huán)化合物熒光光譜和熒光產率常隨取代基而改變，取代基對熒光體的激 發(fā)和發(fā)射光譜以及熒光效率的影響規(guī)

12、律和機理，是人們甚為光注的領 域，可惜人們對激發(fā)態(tài)分子的性質了解甚少，影響規(guī)律多出自實驗總 結和猜測。（a）推電子取代基增加熒光 屬于這類基團的有O環(huán)外的前幾或氨基上的非鍵電子（n電子）激發(fā)轉移到環(huán)上而產生的。 由于他們的n電子云幾乎與芳環(huán)上的軌道成品活性，實際上共享了共 軛而電子結構，擴大了共軛雙鍵體系。因此，這類化合物的吸收光譜 與發(fā)射光譜的波長，都比未取代的芳族化合物的波長長，熒光效率也 提高很多，但在應用這類熒光體是要特別小心，因為這類基團都含有 未鍵和的n電子。他們容易與極性溶劑生成氫鍵。當取代基是酸基或 堿基是，在酸堿性介質中容易轉化為相應的鹽或質子化，使熒光強度 減弱甚至消失。（

13、b）吸電子取代基含有吸電子基團的熒光化合物，其熒光強度一般都會減弱，屬于這類 取代基的有羰基 鹵素和 基 等，這類取代基也含有n電子，然而其m電子的電子云并不與芳環(huán) 上的n電子云共平面，這類化合物的n n *躍遷是屬于禁戒躍 遷，摩爾吸收系數(shù)很小（約為102），最低單線激發(fā)態(tài)S1為n，n *， S1 的系間跨越強烈，因為熒光強度都很弱，而磷光強度相 應的增強。氰基是一個很有意思的基團，是不飽和的取代基，它應使取代的化合 物的熒光減弱，但實際結果是表現(xiàn)為退電子的效果一一熒光強度。它 的取代9, 10-二氰基蒽的f不但大于蒽，而且9-氯-10-二氰基蒽的 f也高達0.95，遠大于9-氯代蒽的f (

14、0.11)(C)重原子的取代熒光體取代上重原子之后，熒光減弱，二磷光往往相應增強。所謂重 原子取代，一般指的是鹵素(Cl,Br和I)取代芳烴取代上重原子后熒 光強度一般隨鹵素原子量增加而減弱，這一效應稱為“重原子效應”。 這種效應被解釋為：由于重原子的存在，使得熒光體中的電子自選一 軌道偶合作用加強、S1T1的系間跨越顯著增大，結果導致熒光強度極愛你若、磷光強度增加。飽和烷烴的取代此類取代基對熒光體的熒光強度影響不大，可是，由于可動的飽和 烴基的引入，增加了熒光體的振動和轉動自由度，因而消弱了熒光激 發(fā)光譜和發(fā)射光譜振動結構的分辨率，同時激發(fā)峰和發(fā)射峰略為紅 移。取代基數(shù)量及其所處位置的影響取代基在試劑分子上的位置及取代基的數(shù)量對試劑的熒光量子產率 的影響視具體情況而定，是有一個退電子取代基，處于空間位阻最小 火空間位阻的位置可使熒光增強。對于不同的發(fā)光母體，同類取代基 所處位置不同所表達的熒光強度變化規(guī)律也不相同。另外對熒光的影響還要看取代基的種類，校體積取代基所貢獻的共軛效應小，只是體現(xiàn)出其電荷影響，若一個大的取代基如苯或乙炔基苯 其共軛效應大，取代后擴大了試劑共軛體系，使熒光增強的效應大于 其吸電子是熒光減弱的效應，結果是取代后熒光強度不是減弱二十大 大增強。（f）芳香環(huán)中雜原子的影響雜原子對熒光的影響比較復雜，有時增強熒光，有時減弱熒