熒光定量PCR課件

1、熒光定量PCR熒光定量PCR的概述操作步驟數(shù)據(jù)分析常見問題4123目錄熒光定量PCR的概述1 什么是熒光定量PCR？ 熒光定量 PCR 技術是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。熒光定量PCR的概述2 熒光定量PCR的工作原理Ct 值的 含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。指數(shù)期平臺期 反應最初，雖然產(chǎn)物是指數(shù)增長，但是熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加（圖中 1-18 個循環(huán)）。當累積了足夠的擴增產(chǎn)物，可以產(chǎn)生可檢測的熒光信號時，這個循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即 CT。由于 CT

2、值處于指數(shù)期內(nèi)，這時的反應成分不會抑制擴增反應進行，因此熒光定量 PCR 結果是可靠的，可以準確地反映反應體系中模板的初始量。 CT 值主要由擴增反應體系中模板的初始濃度決定的，且模板的初始濃度越大，CT值越小。熒光定量PCR的概述2 熒光定量PCR的工作原理熒光定量PCR的概述2 熒光定量PCR的檢測方法擴增序列非特異性檢測in here除了引物，還需設計與模板相結合的分子探針 成本高熒光分子結合DNA 只需要引物和熒光分子 方法簡便，降低成本 易產(chǎn)生假陽性擴增序列特異性檢測特異性高，結果不易出現(xiàn)假陽性熒光定量PCR的概述2 熒光定量PCR的檢測方法非特異性熒光定量PCR（以SYBR為例）

3、SYBR Green 熒光染料特異性地摻入 DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號。游離狀態(tài)下的SYBR只能發(fā)出微弱的熒光，但是與DNA結合后，熒光倍數(shù)會增加1000倍，因此可以通過熒光的強度來判斷雙鏈DNA的數(shù)量。 對于假陽性的結果，可以通過溶解曲線來判斷。熒光定量PCR的概述2 熒光定量PCR的檢測方法特異性熒光定量PCR（以Taqman為例） TaqMan探針是一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團，因此探針完整時，檢測不到該探針 5端熒光基團發(fā)出的熒光。但在 PCR 擴增中，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結合處，Taq 酶的 5-3外切將探針酶切

4、降解，使熒光發(fā)射基團與淬滅基團脫離，從而檢測到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步。操作步驟操作步驟1 準備階段實驗材料與試劑槍頭、槍頭盒、 EP 管和八連管等需提前滅菌cDNA分裝，避免反復凍融引物稀釋引物為100M，-20保存使用時再進一步稀釋，保證反應體系中引物濃度為0.4M內(nèi)參-actin，GAPDH 等等操作步驟2 加樣操作制定加樣體系根據(jù)不同的試劑盒和實驗樣本量（cDNA量），選用不同的反應體系設置空白對照每一次加樣和每一對引物都應該設置空白對照，即不加入模板，至 少重復3次，這樣可以降低實驗誤差混勻分裝可以先將

5、引物、酶、水和熒光分子混合，分裝后加入模板，且每一 次混合應多混合幾管，避免分裝過程的損耗操作步驟3 上機操作（以bio-rad為例）1）啟動bio-rad熒光定量PCR儀，開啟熒光定 量檢測系統(tǒng)CFX Manager v1.6。2）選擇 file- New-experiment 3）選擇兩步法+溶解曲線（檢測目的產(chǎn)物的特異性，如果是探針法則不需要溶解曲線）的溫度梯度程序 ，點擊“edit selected”。操作步驟4)程序與參數(shù)輸入最佳退火溫度反應體系與加樣一致照相機的添加是為了實時監(jiān)測熒光信號操作步驟5）編輯排布信息板子的排布和放置樣品時的位置相同熒光分子類型編輯信息，便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計操作步

6、驟6）setting 中 plateType 是白管就選擇白管，透明管就選擇透明管。然后選中白管放置位置，Smple Type 選擇 unkown，勾選上 SYBR（探針就勾選探針）7）然后 start run-close lid start 就可以了。數(shù)據(jù)分析相當量的腫瘤組織和正常組織比，p53 mRNA 改變了多少倍 相對定量給定的血樣中的病毒顆粒數(shù) 絕對定量數(shù)據(jù)分析可以采用兩種方式數(shù)據(jù)分析1 絕對定量 絕對定量是通過樣品的 CT 值和標準曲線進行比較實現(xiàn)的。分析的結果是給定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量的細胞，每微克總 RNA）中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）。當你想找出一個給定樣品的本質(zhì)屬性的時候，

7、就應該使用絕對定量。例：醫(yī)生對一個病人的每毫升血液中病毒顆粒數(shù)感興趣。所以醫(yī)生從 10 毫 升血液中提取 DNA，然后通過對病毒 DNA 特異的熒光定量 PCR 檢測確定病毒顆粒的數(shù)目。通過待測樣本的 CT 值和已知病毒顆粒數(shù)的標準曲線進行比較，醫(yī)生能夠確定在分析的 DNA 樣品中有 10000 個病毒?；谝陨闲畔?，她能夠確定每毫升血中有 1000 個病毒。數(shù)據(jù)分析制作一直基因拷貝數(shù)標準品的標準曲線構建曲線方程式檢測樣品的CT值，帶入方程，算出單位樣品的基因拷貝數(shù)。數(shù)據(jù)分析 相對定量的分析結果是在相當量的試驗組（樣品 A）和對照組（樣品 B）中一個靶基因的相對比率（倍數(shù)差異）。2 相對定量

8、例：研究者分別從 1,000 個癌變的和 1,000 個正常卵巢細胞中提取 RNA，對樣本進行 p53 mRNA 特異地反轉(zhuǎn)錄定量 PCR 實驗 (RT-qPCR) 確定 p53 mRNA 的量，結果顯示了從等量癌變的和正常卵巢細胞中提取的 RNA 樣本中 p53 mRNA 分子數(shù)目的比率，即是 p53 mRNA 的差異倍數(shù)。數(shù)據(jù)分析通常采用2CT 法進行計算（目標基因和參照基因有相似且接近 100% 的擴增效率）。首先，對所有的測試樣和校準樣本，用內(nèi)參基因的 CT 值歸一目標基因的 CT 值：CT(test)= CT(target, test) CT(ref, test)CT(calibra

9、tor)= CT(target, calibrator) CT(ref, calibrator)其次，用校準樣本的 CT 值歸一試驗樣本的 CT 值：CT = CT(test) CT(calibrator)最后，計算表達水平比率：2CT = 表達量的比值常見問題Q-1. 無Ct值（信號）出現(xiàn)A1. 反應循環(huán)數(shù)不夠:一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)試驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號A2. 檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用72延伸的采集。A3. 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。A4. 引物或探針的設計：如探針高于引物的溫度不夠，造成探針為雜交上，而產(chǎn)物已延伸的情

10、況A5. 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起A6. 模板降解：避免樣品制備中雜志的引入及反復凍融常見問題Q-2.陰性對照也出現(xiàn)明顯擴增A1. mix或水被污染。A2. 引物二聚體的出現(xiàn): 在35cycles以后陰性出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合溶解曲線分析。A3. 反應過程探針的降解：用PAGE電泳對探針進行檢測。Q-3.融解曲線不止一個主峰A1. 引物設計不夠優(yōu)化：應避免引物二聚體和發(fā)夾結構的出現(xiàn)。A2. 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。A3. 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。A4. 模板有基因組的污染：RNA

11、提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。常見問題Q-4. Ct值出現(xiàn)過晚A1. 擴增效率低，反應條件不夠優(yōu)化：設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。A2. PCR各種反應成分的降解或加樣量不足。A3. PCR引物太長：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。Q-5.標準曲線的線性關系不佳A1. 加樣存在誤差，使標準品不成梯度。A2. 標準品出現(xiàn)講解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。A3. 引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。常見問題Q-6. 擴增效率低A1. 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。A2. 反應條件不夠優(yōu)化，可適當降低退火溫度或改為三步擴增法A3. 反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板是引入，可將引物濕度稀釋，再加入反應體系中。Q-7. 實驗重復性不好A1. 加樣不準確。A2. 儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度均一性不好。A3. 模板濃度低：樣品初始濃度越低，重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數(shù)。常見問題Q-8. 變性時間和溫度是否合適A1. 大部分的雙鏈DNA在95就開始解鏈了，在有些情況下載90至94都不能很好地變性DNA。由于部分變性，參與反應的探針和引物相應的減少了，因此反應效率