基因工程學(xué)案2

1、第二課時(shí)基因工程操作的基本步驟、目的基因的獲取1.基因的結(jié)構(gòu)（1）原核生卑基因結(jié)構(gòu) 一非編碼區(qū)I 編碼區(qū) rm編碼區(qū)編碼區(qū)卡邏ATGTGCACGTAGTTA編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達(dá)（調(diào)控程序）編碼區(qū)下舞終（不能編碼蛋白質(zhì)）（能編碼蛋白質(zhì)）-非編碼區(qū)真核生物基因結(jié)構(gòu)（2）真核與原核生物基因結(jié)構(gòu)的比較相同點(diǎn)：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有 調(diào)控作用的非編碼區(qū)。不同點(diǎn)：原核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的；真 核細(xì)胞的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。啟動(dòng)子：位于段能與結(jié)合并能起始合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識(shí)別的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種終止子：位于一段特殊的DNA片斷，它能阻

2、礙的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止外顯子：真核細(xì)胞基因DNA中的序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA并進(jìn)而翻譯為蛋白質(zhì)。內(nèi)含子：真核細(xì)胞基因DNA中的_序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA,但隨即被剪除而不翻譯。目的基因的概念主要是指編碼基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子 例如：與生物抗逆性相關(guān)的基因，與生物優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因，藥物和保健品相關(guān)的基因，與毒物降解相關(guān)的基因，以及與工業(yè)所需要酶相關(guān)的基因。目前被廣泛提取使用的目的基因有：、目的基因的獲取的方法（用到哪些工具？）（1）從基因庫(kù)中獲取目的基因基因文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的慨念將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存

3、，各個(gè)受體菌分別含有 這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。部分基因文庫(kù)的建立方法基因組文庫(kù)的建立方法部分基因文庫(kù)的建立方法基因組文庫(kù)的建立方法mRNAk轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNAI合成雙鏈 DNA ( cDNA mRNAk轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNAI合成雙鏈 DNA ( cDNA )插入cDNA 文庫(kù))提取某種生物的全部DNA|用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉?DNA片段|將DNA片段與運(yùn)載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存（基因組文庫(kù)）|分離目的基因文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用 的DNA片段）基因中內(nèi)含子（位于編碼蛋白 質(zhì)序列的非編碼DNA片段）基因多少物種間的基因父流基因組文庫(kù)和cDNA文

4、庫(kù)的主要區(qū)別（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因定義：PCR是.是一項(xiàng)在復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因原理：DNA分子熱變性（在9095 0C時(shí)，解旋，雙鏈分開(kāi)溫度降低又結(jié)合成雙鏈）因此，在PCR技術(shù) 中不需要 （與復(fù)制不同之在處）儀器：PCR擴(kuò)增儀（自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器）條件：作為模板的序列DNA引物（20個(gè)左右堿基的短DNA單鏈）；Taq；dNTP （dATP, dTTP, dGTP和 dCTP）。過(guò)程：Step 1.DNA熱變性（9095 0C）：雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形 一般需要30秒一1.5分鐘Step 2.復(fù)性或退火（5560 0C）：系統(tǒng)溫度

5、降低，結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNA。需要30秒Step 3.延伸（7075 0C）：在酶作用下，合成與模板互補(bǔ)的DNA子鏈，形 Step 4重復(fù)1.2.3步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加一倍一般Taq酶每分鐘合成DNA長(zhǎng)度lOOObp,所以擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度為1500bp對(duì)的特異DNA2. 5分鐘， 75分鐘即可擴(kuò)增出230個(gè)。Q 怎樣從基因文庫(kù)中找到我們所需要的目的基因2 根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核背酸序列、基因的功能、基因在染色體 上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA,以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。Southern印跡雜交（基因探針原來(lái)）的基本步驟待測(cè)核酸

6、樣品的制備： 探針標(biāo)記:Southern 雜交: 放射性自顯影檢測(cè):（3）用化學(xué)方法直接人工合成目的基因蛋白質(zhì)氨基酸序列一niRNA的核背酸序列一目的基因序列一目的基因 針對(duì)：基因比較小，核背酸序列又已知思考：人工合成的目的基因是否具有完整基因結(jié)構(gòu)的基因？二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心(用到哪些工具)1作用：使目的基因在受體細(xì)胞中同時(shí)使目的基因能和發(fā)揮作用。組成：(1)目的基因：?jiǎn)?dòng)子：終止子：標(biāo)記基因：是鑒別受體細(xì)胞中是否含有從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)罷1-E聶達(dá)孫煉出氏田罷1-E聶達(dá)孫煉出氏田質(zhì)粒DNA分子J同一種限制酶處理 |一個(gè)切口兩個(gè)切口兩個(gè)黏性末端獲得目的基因DNA連接酶重組DN

7、A分子(重組質(zhì)粒)實(shí)際操作過(guò)程是用兩種限制酶分別處理目的基因和質(zhì)粒？原因： 三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的工程常見(jiàn)轉(zhuǎn)化方法：(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物和裸子植物。資料：農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物， 而對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。當(dāng)植物體受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量的 酚類(lèi)化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，這時(shí)農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNAC可轉(zhuǎn)移的DNA) 可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的 DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這種特點(diǎn)，如果 將目的基因插入

8、到Ti質(zhì)粒的T-DNA ，通過(guò)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植 物細(xì)胞，并將其插入到植物細(xì)胞中染色體的DNA ,使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持 和表達(dá)。它是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法。優(yōu)點(diǎn)該轉(zhuǎn)化體系是模仿或稱之為利用天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的機(jī)理研究得最清楚,方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛；農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律? ，因此轉(zhuǎn)基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料;農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，易于推廣。農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染植物和裸子植物，對(duì)植物沒(méi)有感染

9、力；Ti質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體上。四目的基因的檢測(cè)與鑒定檢杳是否成功(1 )檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的目的基因方法：DNA 分子雜交技術(shù)基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA 上是否插入了DNA 分子探針轉(zhuǎn)基因生 物的 DNA15 n變性 -15 N14 N 探針轉(zhuǎn)基因生 物的 DNA15 n變性 -15 N14 N ：變性14 N花粉管通道法 這是我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法，是一種十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的方法(我的的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉就是用此 種方法獲得的)。植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃?植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加D

10、NA (含目的基因)，使目 的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞?；驑尫ǎ?jiǎn)巫尤~植物。 是單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高。(2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射法受體細(xì)胞類(lèi)型：.(2)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針?lè)椒?轉(zhuǎn)基因生物 的 mRNADNA 分子雜交技術(shù)15 N變性15 N14 N14 N如果顯示出雜交帶，就表明待測(cè)樣品目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化過(guò)程：目的基因插 叱 農(nóng)桿菌一導(dǎo)入植物細(xì)胞一目的基因整合到植物細(xì)胞染色體上一目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。槍測(cè) 目的舉因是否蒯詳成更白應(yīng)1明=槍測(cè) 目的舉因是否蒯詳成更白應(yīng)1明=白白 操作程序：提純含目的基因表達(dá)載體取

11、受精卵(體內(nèi)或體外受精)f顯微注射 f培養(yǎng)成早期胚胎一移植到子宮或輸卵管f發(fā)育成新性狀動(dòng)物(轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞法。微生物作受體細(xì)胞原因：常用菌：常用法：過(guò)程：Ca2+Ca2+處理感受態(tài) 表達(dá)載體與感受片感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌細(xì)胞態(tài)細(xì)胞混合吸收DNA2.鑒定個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)(1)多細(xì)胞個(gè)體例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。(2)單細(xì)胞生物細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)

12、物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。 課堂訓(xùn)練1.下列有關(guān)基因工程的敘述，正確的是A. DNA連接酶的作用是將兩個(gè)黏性末端的堿基連接起來(lái)B.目的基因?qū)?體細(xì)胞后，受體細(xì) 發(fā)生基因突變 C.目的基因與運(yùn)載 合的過(guò)程發(fā)生在細(xì)D.常使用的運(yùn) 有大腸桿菌、噬菌 動(dòng)植物病毒等 2.某質(zhì)粒上有Sal HindllR BamH I 三 制酶切割位點(diǎn)，同 含有抗四環(huán)素基因 氨節(jié)青霉素基因。入受 胞即體結(jié) 胞外載體 體和請(qǐng)回爺列低題。I 、種限時(shí)還 和抗 利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過(guò)程如圖所示,抗內(nèi)坷草甚圍1/ndllJ 41 Sai I得到轉(zhuǎn)基黠物2亦煙弟陽(yáng)倉(cāng)催化連催化連(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用Sal I酶切，酶切產(chǎn)物用接后，兩個(gè)DNA片段的連接結(jié)果有種。(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用兩種酶對(duì)進(jìn)行切割，以保證重組DNA序列的唯一性。 為篩選出導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入,理由是0將轉(zhuǎn)入抗鹽基因的煙草細(xì)胞培育成完整的植株需要用技術(shù)，愈傷組織經(jīng)進(jìn)而形成完整植株，此過(guò)程除營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加03、根據(jù)基因工程的有關(guān)內(nèi)容在下列橫線上