動(dòng)物肝臟提取以及鑒定實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、關(guān)于動(dòng)物肝臟提取和鑒定實(shí)驗(yàn)技術(shù)第1頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四核酸的分類 DNA (脫氧核糖核酸) 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。 核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。 RNA（核糖核酸） 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。第2頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四核酸的理化性質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑在酸性溶液中容易降解，在中性

2、或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。DNA溶液粘度很大，RNA的粘度較小在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來第3頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四 濃鹽法：利用RNA和DNA在不同鹽濃度溶液中的溶解度不同將二者分離。離子去污劑法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取DNA。 苯酚抽提法：苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制DNase的降解。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA連接鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。基因組DNA的提取方法第4頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)

3、38分，星期四 核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來； 3對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉第5頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四 作用： 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。 2.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制 RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備

4、中常用的蛋白質(zhì)變性劑第6頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四核酸制備中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白質(zhì) 溶菌酶：破碎細(xì)胞 第7頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四核酸提取的主要步驟沉淀核酸，去除鹽類，有機(jī)溶劑等雜質(zhì)除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白變性劑（SDS、異硫氰酸胍等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌除去其它不需要的核酸分子破碎細(xì)胞：研磨、組織勻漿、超聲、凍融；異硫氰酸胍、堿裂解；酶解（溶菌酶）第8頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四注意事項(xiàng)加入RNA

5、降解酶除RNA加入DNA酶抑制劑：檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、EDTA、SDS、苯酚等蛋白變性劑反應(yīng)不宜過于劇烈 避免過酸、過堿及高溫第9頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握用濃鹽法從動(dòng)物組織中的提取DNA方法及其原理。2、學(xué)習(xí)和掌握二苯胺法測定DNA的原理和方法。第10頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四二、實(shí)驗(yàn)原理 核酸在真核細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，用DNP和RNP表示。 DNA-Pro（DNP） 細(xì)胞核 RNA-Pro(RNP) 核仁及細(xì)胞質(zhì)溶于高鹽溶液（1mol/L）, 微溶于低鹽溶液（0.14mol/L）

6、溶于低鹽溶液（0.14mol/L） 微溶于高鹽溶液（1mol/L）第11頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四 核酸含量的測定方法：紫外吸收法、定磷法和分別針對(duì)DNA和RNA的顏色反應(yīng)方法。 脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成-羥基-酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在595nm處有最大的吸收 。 DNA20400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。 第12頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑95%冷乙醇、NaCl固體二苯胺：稱取純二苯胺1g溶于100ml冰醋酸中，加入10m

7、l過氯酸，混勻。臨用時(shí)加1ml1.6%乙醛溶液，所配置試劑應(yīng)為無色。0.14molL NaCl0.05molL 檸檬酸鈉緩沖液(PH=6.8)DNA標(biāo)準(zhǔn)液200ug/ml:DNA鈉鹽用5mmol/L的NaOH配制。氯仿/異戊醇=20：1（V/V）5% SDS第13頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四組織搗碎勻漿機(jī) 第14頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四豬肝8g勻 漿16ml的0.14molL NaCl0.05molL 檸檬酸鈉緩沖液離心，4000r/min ,10min上清（棄掉）沉淀沉淀25ml緩沖液洗滌離心，4000r/min ,20min上

8、清（棄掉）40ml的0.14molL NaCl0.05molL 檸檬酸鈉緩沖液沉淀21ml氯仿/異戊醇4ml 5% SDS振蕩 30 min（保鮮膜封口）加入3.6gNaCl 固體，終濃度為1mol/L離心，3500r/min ,20min吸取上清（量取體積）95%冷乙醇（緩慢加入）邊加邊朝一個(gè)方向緩慢攪動(dòng)DNA粗制品第15頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四第16頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四除去蛋白質(zhì)的方法 SDS（十二烷基硫酸鈉）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA防止DNA酶的降解，提取時(shí)可加入適量EDTA（乙二胺四乙酸

9、）、檸檬酸，以降低DNA酶的活性氯仿一異成醇使蛋白質(zhì)變性，離心除去變性蛋白質(zhì)第17頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四DNA的定量測定第18頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作為待測品。 混勻，60水浴保溫45min，冷卻后，595nm處，比色。第19頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四以吸光度A595nm對(duì)DNA含量（ug）作圖， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的DNA含量。計(jì)算100g豬肝中DNA的含量： 待測樣品中DNA的質(zhì)量25(稀釋倍數(shù)) 稱取豬肝的質(zhì)量=第20頁，共22頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)38分，星期四 勻漿（破碎細(xì)胞）要充分，需剪成小塊。固體NaCl應(yīng)磨碎，加入應(yīng)分批緩慢加入，邊加邊搖，避免局部濃度過大或者未及溶解而沉入氯仿層。變性蛋白質(zhì)層易散，吸