生化與分生實(shí)驗(yàn)課件2電泳技術(shù)

1、電泳技術(shù)電泳的基本原理帶電顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，稱為電泳。帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)。是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測定等。一 .定義帶有電荷的生物分子在電場作用下可發(fā)生移動(dòng)。由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量以及分子量各不相同，在同一電場作用下，各組分的泳動(dòng)方向和速度也各有差異，所以在一定時(shí)間內(nèi)，它們移動(dòng)距離不同，從而可達(dá)到分離鑒定的目的。二.基本原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們在相同電場中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密

2、的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。 -+二、遷移率設(shè)一帶電粒子在電場中所受的力為F，則 F=QE（Q為粒子所帶電荷，E為電場強(qiáng)度）根據(jù)Stoke定律，一球形分子在溶液中運(yùn)動(dòng)所受的阻力F為： F=6rv（v為分子移動(dòng)速度；r為分子半徑；為介質(zhì)黏度） 當(dāng)分子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)， F= F 即 QE= 6rv 移項(xiàng)得 v/E=Q/ 6r v/E表示單位電場強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)速度，稱為遷移率，也稱電泳速度，以表示。因此上式也可表示為： =Q / 6r 從上式可得到以下結(jié)論帶電粒子在電場中的移動(dòng)與: 粒子大小有關(guān)，顆粒直徑愈小愈快 粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快 粒子的形狀有關(guān)

3、，愈接近球形愈快三、影響遷移速度的因素1.電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度是指每厘米的電位降 凝膠兩端距離20厘米，電壓降200伏特，電場強(qiáng)度為10伏特/厘米 電場強(qiáng)度越高電泳速度越快2.溶液的PH值 PH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少3.溶液的離子強(qiáng)度 緩沖液的離子強(qiáng)度越高，電泳速度越慢 一般在0.02-0.24.電滲現(xiàn)象 在電場中液體對固體支持物的相對移動(dòng) 紙或纖維素帶負(fù)電荷，使其接觸的水溶液帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)。 應(yīng)盡量避免選用有電滲作用的支持物四、電泳的分類按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)

4、時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。支持物物理性質(zhì):濾紙及其他纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、粉末電泳、線絲電泳支持物裝置形式分類：平板式電泳、垂直板式電泳、連續(xù)電泳、圓盤電泳按pH的連續(xù)性分類：連續(xù)pH電泳、非連續(xù)pH電泳瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙

5、烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn)1.具有大量微孔2.具有較高的機(jī)械強(qiáng)度 可以在1%或更低濃度下使用3.無毒，不需要催化劑4.具有熱可逆性，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收樣品容易5.生物中性，與別的生物材料結(jié)合性低6.具有高靈敏度放射自顯影7.膠凝溫度34-43 熔化溫度75-90 低熔點(diǎn)瓊脂糖膠凝溫度低于30 (融化溫度高于30 )瓊脂糖凝膠配制聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acry-lamide，簡稱

6、Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑作用下合成的。 一、概述CH2=CHC=ONH2CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH- C=O C=O NH NH2丙烯酰胺N,N-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺優(yōu)點(diǎn) 聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。分類 聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連