基因組文庫的構(gòu)建和應(yīng)用研究進(jìn)展

1、一. 基因組文庫的構(gòu)建和應(yīng)用研究進(jìn)展克隆技術(shù)的發(fā)展核完善，構(gòu)建真核生物大片斷DNA的基因組文庫，并以之為平臺(tái)進(jìn)行基因組序列測(cè)定、因組研究中行之有效的方法 。1基因組文庫是指含有某種生物全部基因的隨機(jī)片斷的重組 DNA克隆群體。genomiclibrary“活期儲(chǔ)蓄所（genomic bank夠在必需時(shí)從基因組文庫中調(diào)出其中的任何片段或目的基因 。21 基因組文庫的產(chǎn)生和發(fā)展向之一。自1973年Cohen構(gòu)建了第一個(gè)質(zhì)粒載體pS101以來，越來越多的克隆載YAC（yeast artificial chromosomeBAC（bacterial artificial chromosome ）及PA

2、C（P1-derived artificial chromosome BIBAC（binary BAC）及TAC（transformationcompetent artificial chromosome）為代表的新型文庫載體，不僅具有第二代載體的所有特征，而且具備了植物的轉(zhuǎn)化功能 。31.1 第一代載體噬菌體是最早使用的克隆載體，其插入片斷僅20 kb左右 。1979年Royal4等確定了在粘粒（Cosmid）載體中克隆大片斷的可能性 。此后粘粒載體用于構(gòu)5建果蠅、小鼠、人等基因組文庫，并從這些文庫中成功分離得到基因。肺炎支原體基因組全序列的測(cè)定就是粘粒文庫的基礎(chǔ)上完成的 噬菌體68cos4

3、6 kb40 kb左右。重組的粘粒可承載外源噬菌體一樣感染大腸桿菌，在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制和增殖。粘（chromosome walking）則所需步行次數(shù)太多很大程度限制了它的應(yīng)用。1.2 第二代載體，第二階段的克隆載體與第一代載體相比 顯著特點(diǎn)是載體的容載能力擴(kuò)大。酵母人工染色體YAC是最早發(fā)展的真正意義上的人工染色體，具備在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制和遺傳所必須的三個(gè)元件：復(fù)制起始區(qū)（origin of replication），參與染色體復(fù)制起始結(jié)構(gòu)的形成；著絲粒（centromere），負(fù)責(zé)染色體向子細(xì)胞的傳遞；端粒（telomere），對(duì)染色體兩個(gè)末端起封口和保護(hù)作用 。酵9母人工染色體的平均插

4、入片段可達(dá)到1 Mb左右，因此構(gòu)建基因組文庫時(shí)只需要較少的克隆數(shù)便可以覆蓋整個(gè)基因組。因此 YAC很快成為構(gòu)建復(fù)雜基因組DNA文庫的主要載體系統(tǒng)。在人類基因組計(jì)劃的早期，YAC文庫被用于基因組框架的構(gòu)建 。10雖然YAC能容載較大的片段但同時(shí)也有一些自身難以克服的缺點(diǎn)：一是嵌合現(xiàn)象的存在。即一個(gè)YAC克隆中的插入子可能來自兩個(gè)或多個(gè)不同的片段，嵌合體的比例達(dá)到40 %60 ，這種現(xiàn)象使染色體步行和基因分離難度加大；二是YAC克隆的穩(wěn)定性差sequence rearrangement）和丟失（insert deletion）現(xiàn)象，這對(duì)染色體物理圖譜的構(gòu)建和基因分離都十分不利；三制了YAC的應(yīng)用1

5、1, 12。因此科學(xué)家開始把眼光轉(zhuǎn)向?qū)ふ腋玫妮d體系統(tǒng)。1992年載體應(yīng)時(shí)而生 。13細(xì)菌人工染色體（BAC）是以大腸桿菌致育因子（因子）為基礎(chǔ)的合成載體。因子具有穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn) 其復(fù)制是嚴(yán)謹(jǐn)型的 在每個(gè)細(xì)胞中僅有12個(gè)，拷貝 減小了插入片段發(fā)生重組的機(jī)率 理論上 因子能夠攜帶1 Mb的外源片段，F(xiàn)在實(shí)際應(yīng)用中克隆的平均大小約為120 kb個(gè)別重組子中含有的基因組DNA最大可達(dá)300 kbYAC載體大但載體擁有YAC載體所缺乏而，科學(xué)家所需的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是以大腸桿菌為寄主，采用電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)化率高 因此構(gòu)，建BAC文庫比YAC文庫更容易；二是BAC載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在 從大腸桿菌中提取質(zhì)粒較方便

6、 載體中的lacZ元件使人們能夠利用顏色差異區(qū)分重組的克隆。三是的復(fù)制子來源于F，因子 可穩(wěn)定遺傳 載體在克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有T7和Sp6聚合酶啟動(dòng)子，可以用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA探針或直接用于插入片段的末端測(cè)序1416，基因 方便快捷；五是。1994年，等發(fā)展了源于P1噬菌體的人工染色體（P1-derived artificialchromosomePAC） P1和因子的特性，通過電擊轉(zhuǎn)化大腸17桿菌細(xì)胞，以單拷貝形式穩(wěn)定傳代，無嵌合體?；赑AC的人類基因組文庫插入片段的大小在60150 kb之間17, 18。PAC載體的一個(gè)不足之處是自身片段較大（約16 kb），構(gòu)建文庫沒有載體（約78kb）效

7、率高，鳥槍法測(cè)序費(fèi)用較PAC載體尚缺乏選擇標(biāo)記19, 20PAC載體在基因分離和YACRGP）已把水稻的PAC文庫用于物理圖譜的構(gòu)建 。211.3 第三代載體， 在候選基因，的功能研究中需要將外源片段進(jìn)行亞克隆 因而工作量大 同時(shí)也有漏失目的DNA片段的可能。近年來，通過對(duì)一些已有的基因組文庫載體進(jìn)行改造后發(fā)展了既可以用于克隆，又能夠直接用于植物轉(zhuǎn)化的大片段雙元細(xì)菌人工染色體（BIBAC）。1997年，Hamilton等結(jié)合BAC載體和根癌農(nóng)桿菌（ Agrobacteriumtumefaciens）雙元載體的特點(diǎn)構(gòu)建了雙元載體BIBAC2這種載體在結(jié)構(gòu)上具有Ri復(fù)制子和抗卡那霉素篩選標(biāo)記因此B

8、IBACHamilton等已將一30kb的酵母DNA和一152 kb的人類基因組DNA通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)成功地導(dǎo)入煙草核基因組，并證明能夠穩(wěn)定遺傳 。221999年等結(jié)合PAC和雙元載體的特點(diǎn)構(gòu)建了植物可轉(zhuǎn)化基因人工染色體（transformation-competent artificial chromosomepYLTAC7TAC載體具有P1復(fù)制子和RipRiA4復(fù)制子能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中穿梭復(fù)制 。231998年，Noutoshiplantartificial chromosome），可插入超過10 Mb的片斷。植物人工染色體可在植物細(xì)胞中自主復(fù)制，使植物超長克隆和表達(dá)成為可能 。242

9、細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建、保存和鑒定近年來在基因組文庫中占主導(dǎo)地位的載體主要是人工染色體載體系列：YAC、BAC和PAC。三種載體中BAC載體具明顯優(yōu)勢(shì)：它嵌合與重排頻率低、易于分離插入 DNA 、操作簡(jiǎn)單和可采用高效的電轉(zhuǎn)化體系等優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了 YAC在轉(zhuǎn)化前無需對(duì)重組子進(jìn)行包裝的優(yōu)點(diǎn)是PAC所不及BAC載體得到了迅速的發(fā)展并在構(gòu)建基因組文庫方面得到了廣泛的應(yīng)用。）的制備、部分酶切（partial digestionlarge-size DNA 連接（ligationtransformation）及克隆的挑?。ㄟx有人工和全自動(dòng)分子生物學(xué)工作臺(tái)技術(shù)（ robotics）兩種 。一般通過lacZ的2

10、5發(fā)現(xiàn)有110 13, 25?，F(xiàn)在又產(chǎn)生了正向選擇的BAC載體pBACe3.6 ，其多克隆位點(diǎn)位于蔗糖致死基因sacB26挑選重組子時(shí)不必進(jìn)行菌落之間的分辨，便于自動(dòng)挑取收集。文庫的保存，已經(jīng)發(fā)展了單克隆保存法 和混合池存放法 兩種方法。后2827者對(duì)較大基因組的生物文庫保存來說是一個(gè)好的選擇。文庫的鑒定內(nèi)容包括插入片段長度、空載率、克隆的多少及細(xì)胞器 DNA的污染等。一個(gè)好的文庫應(yīng)該具有較大的平均插入片段及覆蓋率，較小的空載率，細(xì)胞器DNA的污染率很低 。不同用途對(duì)文庫的要求有很大的差別。如用來大29， 則片段較小有利， 如用于克隆基因和因?yàn)殛栃钥寺〉暮Y選比例最高可以達(dá)到10 以上 。303

11、 細(xì)菌人工染色體文庫的應(yīng)用段基因組文庫基礎(chǔ)上可進(jìn)行大規(guī)模的物理作圖（ physical mapping） 、測(cè)序31（sequencing） 、基因定位克?。╬osition cloning） 及基因轉(zhuǎn)化、分子標(biāo)記3233（molecular marker）的發(fā)掘、著絲粒（ centromere）及比較基因組30, 3534（Comparative genomics）的研究工作36, 37。3.1 圖位克隆基因的圖位克?。╩ap-based cloning）又稱定位克?。╬ositional 的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息，但首先要有一個(gè)根據(jù)目置，構(gòu)建含有大插入片段的基因組文

12、庫（BAC或YAC子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫，用獲得的陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群；找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記和鑒定出分子標(biāo)記所在的大片段克隆以后，段克隆。最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)驗(yàn)證最終確定目的基因的堿基序列 。23.2 物理圖譜的構(gòu)建與全基因組測(cè)序基因組物理圖譜是指一系列DNA的限制性酶切片段，沿染色體的有序排列的編碼區(qū)，也包含了內(nèi)含子和基因的調(diào)控區(qū)。物理圖譜的構(gòu)建是通過菌落雜交，PCR和在一起 。31基因組測(cè)序需要把已確定物理位置的克隆大片段進(jìn)行亞克隆，BAC文庫性質(zhì)穩(wěn)定，保真度高，而且與普通的自動(dòng)化DNA制備純化程序相容，所以成為大規(guī)模測(cè)序中優(yōu)先選擇的克隆系統(tǒng) 。BAC既可以亞克隆到質(zhì)粒上進(jìn)行測(cè)序，也可32手段難以發(fā)現(xiàn)的大量可能存在的基因最終將會(huì)通過基因組測(cè)序得以認(rèn)識(shí)和克隆。3.3 轉(zhuǎn)基因研究，遺傳轉(zhuǎn)化是克隆基因驗(yàn)證和表達(dá)調(diào)控研究的必經(jīng)步驟 也是基因克隆和基因BAC的插入較大究。目前，轉(zhuǎn)基因已成為研究基因的功能、時(shí)空調(diào)控和表