3RNA加工水平的調(diào)控課件

1、三、 RNA加工水平的調(diào)控RNA加工：剪切 (cleavage)修剪 (trimming)剪接 (splicing)修飾(modification)戴帽” (capping) m7Gppp “接尾” (tailing) PolyA. 編輯 (editing)RNAi降解三、 RNA加工水平的調(diào)控RNA加工：（一）切除多余序列1. 基因間序列的除去2. 內(nèi)元的除去 可變剪接(alternative splicing) 調(diào)控基因的表達(dá)，以適應(yīng)生理的需求?？勺兗羟械慕Y(jié)果，一個單基因轉(zhuǎn)錄得到的mRNA前體，可以產(chǎn)生多個蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)同源體(isoform)。 （一）切除多余序列3RNA加工水平的調(diào)控

2、課件（二）堿基修飾差不多所有RNA都是含有不同數(shù)量的修飾成分，尤以tRNA和snRNA為最多。迄今RNA中的修飾成分發(fā)現(xiàn)已近百種，但對其功能的認(rèn)識還不多。（二）堿基修飾差不多所有RNA都是含有不同數(shù)量的修飾成分，（三）RNA編輯 1986年Berme等人從錐體蟲中發(fā)現(xiàn)的一種新的RNA加工方式。當(dāng)時發(fā)現(xiàn)錐體蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基(Co)基因與酵母或人的相應(yīng)基因相比，在編碼蛋白的170位氨基酸附近有一移碼突變。比較錐體蟲Co基因與其轉(zhuǎn)錄物的序列，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄序列在相應(yīng)上述移碼突變位點(diǎn)附近有四個不被基因DNA所編碼的額外的尿苷酸，這四個尿苷酸正好校正了基因的移碼突變。（三）RNA編輯 1986年B

3、erme等人從 480 490 500 510 mRNA： UUA GGU AUA AAA GUA GAU UGU AUA CCU GGU AGG UGU AAU蛋白序列 ：L G I K V D C I P G R C N DNA： TTA GGT ATA AAA GTA GA* * G* A* A CCTGGT AGG TGT AAT核酸序號以mRNA起始密碼AUG的A開始編號。下劃線標(biāo)出與人及酵母相應(yīng)蛋白相同的氨基酸。 480 錐體蟲T.buucei亞種mRNA的編輯(不是全部)mRNA 起始密碼 編輯區(qū)域 5區(qū) 編碼區(qū) 3及PolyA 區(qū)Co + 40Co ？ 39418 321Cyb

4、 + + 340 140 MURF2 + 264 斜線坐標(biāo)時插右邊表示刪去U。斜線右表示基因中有無起始密碼。右邊表示編輯中有無構(gòu)建起始密碼。錐體蟲T.buucei亞種mRNA的編輯(不是全部)Mechanism of edtingRNA editing is catalyzed by a complex with seven major polypeptides, two of which correspond to distinct ligases. U deletion and U insertion involve gRNA-directed endonuclease cleavage

5、of the pre-mRNA (shown by an arrowhead), either 3-U-exo or TUTase acting on the upstream fragment, and RNA ligase rejoining the mRNA.Mechanism of edtingRNA editingR, purine(s); Y, pyrimidine(s). These two forms of editing use distinct cleavage activities and distinct ligase enzymes, and the 3-U-exo

6、is not a reverse TUTase reaction , which is indicated by the unequal sign. gRNAs have three main portions: a 5 region to anchor the gRNA to the mRNA just downstream of the editing site and direct the cleavage, a central region to guide the U deletions and insertions at mismatches in base pairing wit

7、h the pre-mRNA, and a 3 oligo(U) that may tether the very purine-rich upstream pre-mRNA. Many additional conserved gRNA features have also been noted. Dotted lines indicate potential base pairs that could serve in a ligation bridge. R, purine(s); Y, pyrimidine(s)Model of the 19S and 3540S RNA editin

8、g complexes revisited. Polycistronic minicircle transcripts assemble into 19S gRNA processing complexes, which process the 5 most gRNAs into monocistrons (gray boxes). These complexes further associate with pre-edited mRNA and other proteins to form 3540S RNA editing complexes that produce edited mR

9、NAs. Red,endonuclease; yellow, TUTase; green, RNA ligase; closed arrowhead, editing site. Model of the 19S and 3540S RN3RNA加工水平的調(diào)控課件Current understanding of U deletion and U insertion. Current understanding of U del編輯的生物學(xué)意義1. 校正移碼突變：Co2. 控制轉(zhuǎn)譯：產(chǎn)生起始密碼，MURF2 除去起始密碼，錐體蟲(C.fasciculate) MURF-3 產(chǎn)生終止密碼，T. b

10、rucel Co.3.擴(kuò)充遺傳信息。T.burceil Cyb基因:在其固有起始密碼上游構(gòu)造新的起始密碼，從而擴(kuò)展了21個核苷酸的轉(zhuǎn)譯序列。另外兩種錐體蟲C.fasclculata和L.tarentolae的Co基因也用這種方法增加了18個密碼子。編輯的生物學(xué)意義1. 校正移碼突變：CoT. brucel的Co最突出，在158個位點(diǎn)插入394個U，在9個位點(diǎn)刪去18個U，實際增加376個U，增加數(shù)占成熟的Co轉(zhuǎn)錄物編碼區(qū)總長度的55。RNA編輯是對中心法則的重要補(bǔ)充。T. brucel的Co最突出，在158個位點(diǎn)插入394個（四）反義RNA 基本原理是通過堿基配對與mRNA結(jié)合，形成二聚體阻斷

11、其表達(dá)功能。1. 反義RNA在胞質(zhì)內(nèi)與mRNA形成RNA:RNA二聚體使其不能與核糖體結(jié)合。2.反義RNA在核內(nèi)與新生mRNA結(jié)合，二聚體不能運(yùn)輸出核外。3.反義RNA：mRNA二聚體易被酶降解。4. 堿基修飾作用。 mRNA中A轉(zhuǎn)變?yōu)?I， A I， I-U對不穩(wěn)定，可使雙鏈拆開。（四）反義RNA 基本原理是通過堿基（五）RNA干涉(RNA interference,RNAi)與microRNAs（miRNAs) RNA干涉是2019年首次在線蟲(C.elegans)中發(fā)現(xiàn)并證明的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制，利用雙鏈RNA 的介導(dǎo)可以特異性地降解相應(yīng)的mRNA，阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，隨后發(fā)現(xiàn)這種

12、現(xiàn)象廣范存在于從真菌到植物、從無脊椎動物到哺乳動物的各種生物中。（五）RNA干涉(RNA interference,RNA3RNA加工水平的調(diào)控課件3RNA加工水平的調(diào)控課件RNAi和miRNA的特征轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制具有很高的特異性能夠非常特異地降解與之相應(yīng)的單個內(nèi)源基因的mRNARNAi和miRNA的特征轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制RNAi抑制基因的表達(dá)具有很高的效率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量的雙鏈RNA能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。這表明很可能存在干涉效應(yīng)分子的擴(kuò)增機(jī)制。RNAi抑制基因的表達(dá)具有很高的效率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持

13、，在線蟲中干涉效應(yīng)甚至可以傳到后帶中去，這說明RNAi干涉機(jī)制中可能存在維持mRNA降解序列特異性的信號小分子。RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持，RNAi的意義及應(yīng)用前景生物的watchdog 抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動，防止自私基因序列的過度增殖，對生物體的發(fā)育和基因的調(diào)控可能也有重要作用。RNAi的意義及應(yīng)用前景生物的watchdog產(chǎn)生抗病毒的植物和動物研究新基因的功能人類疾病的基因治療國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊（）P267。RNAi的作用機(jī)制及其應(yīng)用。產(chǎn)生抗病毒的植物和動物國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊（）P26RNAi的負(fù)向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，只要有這一段很短

14、的同源序列，表達(dá)就會被抑制。RNAi的負(fù)向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，只要有這一段很短的（六）mRNA的降解mRNA的結(jié)構(gòu)（六）mRNA的降解mRNA的結(jié)構(gòu)3RNA加工水平的調(diào)控課件3RNA加工水平的調(diào)控課件國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊（）P。真核生物中降解機(jī)制研究進(jìn)展。國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊（）P。真核生物中影響mRNA穩(wěn)定的因素5端帽子結(jié)構(gòu)5非編碼區(qū)（ 5UTR)開放閱讀框的降解序列3非編碼區(qū)（ 3UTR) IRE（鐵離子相關(guān)區(qū)域），AREBP在一般的細(xì)胞RNA代謝中起著重要作用，其結(jié)合力受細(xì)胞內(nèi)鐵離子的調(diào)節(jié)，保護(hù)mRNA的穩(wěn)定性。 ARE（A-U富集區(qū)），含50150堿基，有多個AUUUA重復(fù)

15、序列，U的百分比含量對穩(wěn)定有重要意義。polyA和PABP Human PABP MW 72000KD 形成2527核苷酸結(jié)合區(qū)。影響mRNA穩(wěn)定的因素5端帽子結(jié)構(gòu)Formation of circular eukaryotic mRNA by protein-protein interactions of eIF4E and eIF4G (binding to the m7G cap), poly(A)-binding protein I (PABP) Force-fieldelectron micrographFormation of circular eukaryot1.脫腺苷酸依賴型降

16、解真核細(xì)胞中最主要的降解方式，其降解過程如下： polyA核酸水解酶水解polyA尾巴， polyA縮短。 polyA能結(jié)合一種稱為polyA結(jié)合蛋白(PABP)的特異蛋白，只有當(dāng)polyA縮短至1015個殘基時，PABP便不能與之結(jié)合，脫帽過程被啟動。脫帽時由脫帽酶Dcp1切除mRNA5端鳥苷酸形成的帽子結(jié)構(gòu)。脫帽后的mRNA 很容易被5 3核酸外切酶識別水解，另外真核生物的mRNA也可以在脫腺苷酸后以3 5方向被降解，但這種作用很小。1.脫腺苷酸依賴型降解真核細(xì)胞中最主要的降解方式，其降解過程3RNA加工水平的調(diào)控課件脫polyA尾巴的調(diào)節(jié) Poly(A)核酸酶的活性受Ccr4和Caf1的

17、正調(diào)節(jié)脫帽過程的調(diào)節(jié) 在翻譯過程中，mRNA被翻譯起始因子eIF4E,eIF4G及PABP包圍。eIF4E蛋白與5端帽子連接，而且eIF4G可加強(qiáng)他們之間的連接，eIF4G是一種大分子蛋白質(zhì)，同時與eIF4E和PABP發(fā)生關(guān)聯(lián)。這種結(jié)構(gòu)保護(hù)mRNA的5和3端不受脫帽酶和脫腺苷酶的降解。一旦上述的穩(wěn)定環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞，polyA水解，PABP脫離，緊接著發(fā)生脫帽反應(yīng)。脫polyA尾巴的調(diào)節(jié)線粒體中的mRNA的降解與真核生物的細(xì)胞質(zhì)中的情形相反 polyA促進(jìn)降解，是降解的信號。線粒體中的mRNA的降解與真核生物的細(xì)胞質(zhì)中的情形相反2.無義密碼介導(dǎo)的mRNA的降解Nonsense mediated

18、mRNA decay N M D2.無義密碼介導(dǎo)的mRNA的降解Nonsense media突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤突變和剪接錯誤發(fā)生無義突變和移碼突變的mRNA和從核內(nèi)逃逸的未經(jīng)剪接還有內(nèi)含子的mRNA發(fā)生無義突變和移碼突變的mRNA和從核內(nèi)逃逸的未經(jīng)剪接還有內(nèi)Is it important? Absolutely! 為害極大！ NMD probably evolved to eliminate abnormal transcripts due to routin

19、e errors in gene expression. For example, inefficient or inaccurate pre-mRNA splicing can generate an intron-derived in frame nonsense codon, or a shift in the reading frame and an exon-derived nonsense codon downstream of the shift. Is it important? Absolutely!NMD降解過程： 當(dāng)mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，立即同核糖體結(jié)合并開始翻譯，如

20、果存在無義突變密碼子則會使翻譯提前終止。隨著翻譯的終止，一組由核糖體部分組分和相關(guān)因子組成的物質(zhì)會繼續(xù)向下游移動與一段下游元件（DSE）相遇，形成一個異常的核蛋白結(jié)構(gòu)，引起mRNA的5端水解一個或二個核苷酸殘基，完成脫帽反應(yīng)，脫帽后的mRNA則迅速被5核酸酶水解。NMD降解過程：3RNA加工水平的調(diào)控課件Nonsense mediated decay of mRNAsDAHLBERG J. E. et.al. RNA 2019;9:1-8Copyright 2019 by RNA SocietyNonsense mediated decay of mRNNonsense mediated de

21、cay of mRNAsDAHLBERG J. E. et.al. RNA 2019;9:1-8Copyright 2019 by RNA SocietyNonsense mediated decay of mRNexon junction complex (EJC)exon junction complex (EJC)Nonsense-mediated decay (NMD). Following splicing in the nucleus, the exon junction complex (EJC), which contains UPF3 (a core protein of t

22、he NMD pathway), is associated with the transcript, and the resulting messenger ribonucleoprotein is exported to the cytoplasm. In the cytoplasm, a second NMD core protein, UPF2, binds to UPF3. Ribosomes associate and translate the mRNA, but are stalled on encountering a premature termination codon

23、(PTC). This results in binding of the SURF complex (comprising SMG1, UPF1 and the peptide-release factors eRF1 and eRF3) to the ribosome. UPF1 also binds UPF2, thereby linking the EJC to the PTC. Phosphorylation of UPF1 by SMG1 leads to dissociation of eRF1 and eRF3 and binding of the SMG7 adaptor p

24、rotein. Subsequent steps that are still being elucidated lead to mRNA decay by various pathways. b | Non-stop decay. Translation of an mRNA that lacks a stop codon results in ribosomes traversing the poly(A) tail, displacing poly(A)-binding protein (PABP) and stalling at the 3 end of the mRNA. One m

25、odel proposes that, in yeast and mammalian cells, Ski7, an adaptor protein that functions as a molecular mimic of tRNA, binds to the A site on the stalled ribosome to release the transcript, and then recruits the exosome. The exosome degrades the poly(A) tail and mRNA body. In another pathway descri

26、bed in Saccharomyces cerevisiae, in the absence of Ski7, the displacement of PABP by the translating ribosome renders the mRNA susceptible to decapping and 5 3 decay by the 5 3 exoribonuclease Xrn1. c | No-go decay. Ribosomes can stall within the open reading frame (ORF), for example, on encounterin

27、g a strong secondary RNA structure. The Dom34 and Hbs1 proteins bind the transcript near the stalled ribosome and initiate an endonucleolytic cleavage event near the stall site. This releases the ribosome and generates two mRNA fragments, each with a free end exposed for exonucleolytic decay by the

28、exosome and Xrn1, respectively. Nonsense-mediated decay (NMD).mRNA編碼區(qū)3端附近的一個下游元件（DSE)是無義mRNA降解必需的無義密碼子與最靠近3端的外顯子之間的相對位置決定了無義mRNA是否被降解大于5055個核苷酸，降解；小于50個核苷酸則不被降解。mRNA編碼區(qū)3端附近的一個下游元件（DSE)是無義mRN3RNA加工水平的調(diào)控課件3RNA加工水平的調(diào)控課件3RNA加工水平的調(diào)控課件Garneau et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 113126 (Februar

29、y 2019)Garneau et al. Nature Reviews Nonsense-mediated mRNA decay: from vacuum cleaner to Swiss army knifeGenome Biology 2019, 5:218 Nonsense-mediated mRNA decay: Vacuum cleanerVacuum cleanerSwiss army knifeSwiss army knife1.國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊（）：。真核生物細(xì)胞中的無義介導(dǎo)mRNA降解機(jī)制。2.遺傳學(xué)報Acta Genetica Sinica , November 2

30、019 , 31 (11) : 13211326 NMD 作用的順式調(diào)控元件3. Nonsense-Mediated mRNA Decay: Splicing, Translation And mRNP DynamicsLynne E. MaquatNature Reviews Molecular Cell Biology 5, 89-99 (February 2019)參考文獻(xiàn)1.國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊（）：。真核3.無終止密碼子mRNA降解途徑3.無終止密碼子mRNA降解途徑These data suggest that nonstop decay is initiated when th

31、e ribosome reaches the 3 terminus of the message RNA These data suggest that nonsto3RNA加工水平的調(diào)控課件Science, 2019; 295:2258An mRNA Surveillance Mechanism That Eliminates Transcripts Lacking Termination Codons.Science, 2019; 295:2262Exosome-Mediated Recognition and Degradation of mRNAs Lacking a Terminat

32、ion Codon.Science, 2019; 295:22584.no-go decay So what happens when RNA accumulates a mutation that hampers the ribosomes ability to translate it? For example if a large stem loop of other RNA fold impeded the ribosomes path along the mRNA. 4.no-go decay So what happens 3RNA加工水平的調(diào)控課件5.核酸內(nèi)切酶降解mRNA直接降

33、解核酸內(nèi)切酶活性受到調(diào)節(jié) 如哺乳動物的RNaseL通常不具活性，但其與2，5磷酸二酯鍵相連的寡腺苷酸結(jié)合時才具有活性，而后者在雙鏈RNA存在時才產(chǎn)生。5.核酸內(nèi)切酶降解mRNA直接降解6.馬方綜合癥(Marfan syndrome) 6.馬方綜合癥(Marfan syndrome) 馬方綜合征,是一種常染色體顯性遺傳的全身性結(jié)締組織疾病, 主要累及眼、骨骼和心血管系統(tǒng), 95%的患者死于心血管并發(fā)癥-主動脈夾層、破裂和充血性心力衰竭。 未治患者的平均壽命，男性30歲左右，女性約40歲。嬰幼兒患者多因心臟瓣膜病變所致的充血性心力衰竭而夭折。馬方綜合征,是一種常染色體顯性遺傳的全身性結(jié)締組織疾病,

34、 主馬方綜合癥是一種結(jié)締組織疾病，所以影響許多結(jié)構(gòu)，包括骨胳、肺、心臟、眼睛和血管。該疾病通常以細(xì)長肢為特征。馬方綜合癥是一種結(jié)締組織疾病，所以影響許多結(jié)構(gòu)，包括骨胳、肺3RNA加工水平的調(diào)控課件3RNA加工水平的調(diào)控課件流行病學(xué)和發(fā)病率 1990年我國的一組流行病學(xué)統(tǒng)計報告發(fā)病率約為1.72/10,000人，2019年在蘇格蘭進(jìn)行的一項人口調(diào)查報告MS的最低流行病率為1/14,217 (7.03/100,000人)，發(fā)病率達(dá)1/9802，最近估計的發(fā)病率約為1/3-5,000人。 流行病學(xué)和發(fā)病率 1990年我國的一組流行病學(xué)統(tǒng)計報告發(fā)病率Figure 2: Pedigrees repres

35、enting inheritance of Marfan Syndrome in the Summers family. Figure 2: Pedigrees representi3RNA加工水平的調(diào)控課件 1896年Antoine Bernard Marfan第一次描述了一個叫Gabrielle P.的5歲半女孩，并稱之為瘦長肢體癥(dolichostenomelia)。 1972年Hecht和Beals認(rèn)為其實該女孩患的是先天性攣縮性蜘蛛指癥(Congenital Contractural Arachnodactyly，CCA，也稱作Beals綜合征)。 1896年Antoine Ber

36、nard Marfan第一3RNA加工水平的調(diào)控課件3RNA加工水平的調(diào)控課件3RNA加工水平的調(diào)控課件馬方綜合癥相關(guān)歷史名人和報道三國志中對天生異相的蜀主劉備的描述是：“身長七尺五寸，垂手下膝，顧自見其耳?！?美國總統(tǒng)林肯 籃球球星克里斯帕頓（Chris Patton）奧運(yùn)會排球隊隊員海曼（Flo Hyman），死于馬方綜合征中的主動脈瘤破裂小提琴家帕格尼尼四川排球運(yùn)動員朱剛、楊懷清喀麥隆球星維維安?！翱植来蠛唷崩?？馬方綜合癥相關(guān)歷史名人和報道3RNA加工水平的調(diào)控課件Health note: Does Obama have Marfan Syndrome?Posted on July 1

37、st, 2019 by Nancy ReyesHealth note: Does Obama have M分子遺傳學(xué)表明符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的MFS患者有7090發(fā)生了致病性FBN1基因突變。分子遺傳學(xué)表明符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的MFS患者有7090發(fā)生了致FBN1是一種分子量為320kd的糖蛋白，由2871個氨基酸組成，是構(gòu)成細(xì)胞外微纖絲的主要蛋白之一。FBN1是一種分子量為320kd的糖蛋白，由2871個氨基酸B.Loeys等通過篩選95個診斷為馬方綜合征病人FBN1基因的所有65個外顯子，發(fā)現(xiàn)在93個馬方綜合征病人中發(fā)現(xiàn)了85個FBN1基因突變，頻率為91。鑒定出的突變主要由三類組成： .41個錯義突變；

38、 .13個無義突變和20個移碼突變引起的提前終止密碼； .11個突變影響剪接或引起框缺失。如果NMD起作用，則這些突變基因的mRNA降解，不發(fā)生馬方綜合癥；否則產(chǎn)生大量的異常蛋白質(zhì)。B.Loeys等通過篩選95個診斷為馬方綜合征病人FBN1基7.玉米CMS-S育性恢復(fù)機(jī)理研究7.玉米CMS-S育性恢復(fù)機(jī)理研究CMS產(chǎn)生的原因CMS產(chǎn)生的原因CMS的遺傳特性rrNrrSrrSRRNRrSrrSrSSRRSSrFertileSterileFertileFertileGametophytic CMSSporophytic CMSCMS的遺傳特性rrNrrSrrSRRNRrSrrSrSNow that

39、 12 mtDNA regions associated with CMS have been identified, it is striking how often the events involve ATP synthase subunit gene promoter regions and portions of coding regions (Hanson and Bentolila, 2019, Plant Cell, preview).與CMS相關(guān)的線粒體片斷Now that 12 mtDNA regions as實驗材料S-Mo17rf3rf3 (S)S-Mo17Rf3Rf3

40、 (F)N-Mo17rf3rf3(N) 實驗材料S-Mo17rf3rf3 S-Mo17Rf3Rf3 orf355-orf77的不同拷貝ProbeN S F6625bp4768bp1.8kborf355/BamHIorf355orf771068bp234bp11bporf355-orf77的不同拷貝ProbeN S 2.8kb和1.6kb轉(zhuǎn)錄本的末端位點(diǎn)1583bp2741bp1583bp157bp19bp14bp261bp190bp1068bporf355orf77cox130bp1160bpcox2orf355orf772.8kb和1.6kb轉(zhuǎn)錄本的末端位點(diǎn)1583bp2741bGCTGGG

41、TTTC TTATGTTAGG AAAAAGAGGG TTCCAAAATC CTTTAAACAA ATCCGGCACT TGCTGCGGGA ACTTCATTGT GGGCAGTTCC CCACAGAAGA TGACCTGGCA CTTATCGAGA TGTTGTGGAC GTATCACCAT AGTTCTTAGC TGTCCGTATT GGCGGTTAGT AAGTAGTTTG GTTTCTAGGA GGAAATTGGA TTACTTATGA GTTTCTTCGG TGCTAAAGTA TACAAGCACA TGTCCAATCT ACATAAAGAT ACCAACCAGG TATCTACTTC AAAGACAGGG CGTCGGCGAT CCTCTACTAT TAAGAGACAG ATAACAATGG TGCCGACAGA GATGGACAGA ACTGCAGAGA ATACCTCTCC GGAGAAGTCC TTACATGTCT CAAACTAAAT AAATCCAACC AATAGTGAAA CTGAAACAAA AAACACGTCT CTTACACACG AGAGACACTG TTGAGTCTCT CTATACTATT TTCAGTATAG