β內(nèi)酰胺酶(拮抗劑)杯碟法等檢測方法-內(nèi)部資料課件

1、內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）管控與檢測方法現(xiàn)場講解深圳市易瑞生物技術有限公司 主要內(nèi)容主要內(nèi)容：深圳市易瑞生物技術有限公司簡介認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測方法深圳易瑞內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓牧場內(nèi)酰胺酶的建議管控方法區(qū)分內(nèi)源性與外源性內(nèi)酰胺酶的方法移液槍操作注意事項深圳市易瑞生物技術有限公司簡介公司簡介：企業(yè)成長趨勢與相關榮譽企業(yè)承擔部分國家科研項目企業(yè)部分專利企業(yè)產(chǎn)品第三方驗證報告易瑞生物產(chǎn)品簡介深圳市易瑞生物技術有限公司簡介企業(yè)成長趨勢與相關榮譽深圳市易瑞生物技術有限公司簡介企業(yè)承擔部分國家科研項目科技部科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金項目（項目編號：09C26214425280）科

2、技部國際科技合作專項項目（項目編號：2011DFA32930）國家“十二五”科技支撐計劃項目（項目編號： 2012BAK17B10）科技部科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新基金（項目編號： 13C26214424714 ）深圳市科技研發(fā)資金技術研究開發(fā)計劃深港創(chuàng)新圈合作研發(fā)項目（項目編號：JSE201109160036A）深圳市2013技術創(chuàng)新計劃技術攻關項目（項目編號：重2013-027）深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目（項目編號： CXZZ20120615163555764）深圳市技術研究開發(fā)計劃-國際科技合作項目（項目編號： ZYA201007070114A）深圳市易瑞生物技術有限公司簡介企業(yè)承擔

3、部分國家科研項目國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心國家獸藥殘留基準實驗室（華南農(nóng)業(yè)大學）國家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（南京）技術復核鑒定： 深圳市易瑞生物技術有限公司生產(chǎn)的試紙條：簡便、快速、靈敏；檢測結果與液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定結果相符。深圳市易瑞生物技術有限公司簡介易瑞生物部分產(chǎn)品簡介認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）什么是內(nèi)酰胺酶 -內(nèi)酰胺酶是由多種酶組成的酶家族，是一種由細菌產(chǎn)生的能水解-內(nèi)酰胺類抗生素的酶。這些酶的基因存在于細菌的染色體或質(zhì)粒中。-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細菌對(內(nèi)酰胺類)抗菌藥物耐藥最常見的機制，在各種耐藥機制中占 80%；絕大

4、多數(shù)致病菌產(chǎn)生青霉素類和頭孢菌素類耐藥性的主要原因即為耐藥菌產(chǎn)內(nèi)酰胺酶所致。 特別注意： 1個產(chǎn)超廣譜內(nèi)酶胺酶（ESBL）菌株在生鮮牛乳體外培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生內(nèi)源性-內(nèi)酰胺酶的活力（50 85 U/ml）。認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）什么是內(nèi)酰胺酶 其他相關文獻指出： 1.獸醫(yī)臨床統(tǒng)計試驗表明： 患病乳牛長期使用-內(nèi)酰胺類抗生素導致細菌產(chǎn)生耐藥性； 耐藥菌自身能夠代謝產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶； 不同區(qū)域分布、不同品種乳牛、不同類型的抗生素使用之后內(nèi)源性-內(nèi)酰胺酶的在奶中的分布情況各不相同。 2.引起乳房炎的主要病原菌對青、鏈霉素有很強的耐藥性。在杯碟法培養(yǎng)中如果存在耐藥菌

5、即使無-內(nèi)酰胺酶添加也不能產(chǎn)生青霉素抑菌圈（內(nèi)源性酶杯碟法一樣可以檢出）。認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）內(nèi)酰胺酶的單位 1.中國藥典（2005版）定義的-內(nèi)酰胺酶活力單位為：規(guī)范化的-內(nèi)酰胺酶活性濃度標識U/mL，這里的活性單位U特指：37，每小時分解青霉素活性單位的量。 2.-內(nèi)酰胺酶的活性單位定義為：在特定條件下（37），1分鐘內(nèi)轉化1微摩爾底物（青霉素），或者底物中1微摩爾有關基團所需的酶量，稱為一個國際單位（IU）。 由以上內(nèi)容可知： 因活性無法準確獲得，且抗原抗體反應的量受樣本基質(zhì)等均有影響，在U與IU兩個單位間無絕對的換算關系。 認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（

6、拮抗劑）認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）內(nèi)酰胺酶的分類 -內(nèi)酰胺酶按照降解產(chǎn)物可分為4類： 第一類為頭孢菌素酶 第二類為青霉素酶和超廣譜酶 第三類為金屬酶 第四類為其他不能被克拉維酸完全抑制的青霉素酶 （應用最廣泛的為前兩類） 內(nèi)酰胺酶按照抑制劑作用可分為3類： 舒巴坦敏感的內(nèi)酰胺酶（杯碟法檢測該類） 克拉維酸敏感的內(nèi)酰胺酶 他唑巴坦敏感的內(nèi)酰胺酶 （對酶的抑制作用強度依次為：他唑巴坦舒巴坦克拉維酸）認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認識牛乳中的內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）內(nèi)酰胺酶的危害 隨著抗生素的不合理應用，細菌的耐藥性隨之產(chǎn)生，細菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，-內(nèi)酰胺酶仍是細菌對抗生素耐藥的主要原因，微量的內(nèi)

7、酰胺酶對人體不會產(chǎn)生明顯的危害。內(nèi)酰胺酶的本質(zhì)是一種蛋白，攝入體內(nèi)之后，會被分解，不會長期存在體內(nèi)；但是，病人在服用內(nèi)酰胺類抗生素后，再喝下含有內(nèi)酰胺酶的牛奶，那么抗生素的作用就會減弱，從而影響疾病的治療。時間久了，臨床上將無藥可用，即產(chǎn)生所謂的超級細菌。 同時，對于未殺菌的鮮奶喝入人體后，耐藥菌將長期生存在人體內(nèi)使得人體對于抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，最終因抗生素藥物治療無效導致某些尋常疾病因無藥可救而奪去人類性命。內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測方法內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測方法舒巴坦敏感的內(nèi)酰胺酶檢測杯碟法 本檢測方法為間接法，用對青霉素類藥物絕對敏感的標準菌株藤黃微球菌作為指示菌，利用舒巴坦特異性抑制

8、-內(nèi)酰胺酶的活性間接測定樣品是否含有-內(nèi)酰胺酶類藥物。在參照杯（本方法中的 C 和 D 杯)能證明加入的舒巴坦有活性的前提下比較判定杯(本方法中的 A 和 B 杯)抑菌圈直徑，如果抑菌圈直徑相差 3mm，即兩杯中的抗生素均未被分解，證明樣品中無-內(nèi)酰胺酶殘留；如果抑菌圈直徑相差3mm，即未加舒巴坦的 A 杯中抗生素被分解，而加入舒巴坦的B杯中抗生素未被分解，證明樣品中有-內(nèi)酰胺酶殘留。 本方法的檢出限為0.5U/ml 本方法單樣檢測時間為 24 小時。 以上內(nèi)容參考蒙牛乳業(yè)-內(nèi)酰胺酶類藥物檢測作業(yè)指導書P.7內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測方法內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測方法深圳易瑞抗原抗體法快速檢測試紙

9、條法 本檢測方法亦為間接法，利用-內(nèi)酰胺酶在原奶中強大的降解內(nèi)酰胺類抗生素的能力，人為向原奶中添加一定濃度的內(nèi)酰胺類抗生素，經(jīng)過一定時間的溫育反應后用易瑞抗原抗體反應體系檢測內(nèi)酰胺類殘留，如果原奶中類抗生素為陽性(+)，即添加的類抗生素未被分解掉，證明原奶中無-內(nèi)酰胺酶殘留；如果原奶中抗生素為陰性(-)，即添加的抗生素被分解掉，證明原奶中有-內(nèi)酰胺酶殘留。 本方法的檢出限： 0.25-0.5U（31min）、0.75-1.5U（22min）以及2-3U（15min）； 本方法的檢測時間為15-31分鐘不等 本方法31分鐘檢出限與杯碟法非常吻合（據(jù)江蘇省質(zhì)檢院驗證）內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測方法內(nèi)

10、酰胺酶（拮抗劑）的檢測方法其他檢測方法 其他檢測方法如碘量法以及E50抗生素間接法等，包括進口 Snap，Charm相關檢測方法對于內(nèi)酰胺酶的檢出限均在4U或以 上，且檢測時間在40分鐘-2小時不等。深圳易瑞內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓深圳易瑞內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓-檢測方法：第一步：溫育器溫度自動跳至40，待其穩(wěn)定；第二步：首先取出白色反應微孔，加入200ul待測樣品，吸打混勻； 第三步：白色微孔混勻后放在加熱器上孵育25分鐘（檢出限約0.5U，與杯碟法真實檢出限基本一致）： 注意： 孵育16分鐘，檢出限為0.75-1.5U 孵育9分鐘，檢出限為2-3U 牛乳中內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙條操作演示深圳易瑞內(nèi)

11、酰胺酶產(chǎn)品操作培訓-檢測方法：第四步：從加熱器上取下白色微孔，將白色微孔中的溶液完全轉入到紅色微孔，在紅色微孔混勻后，完全吸取并轉回至原白色微孔中，再次混勻；并重新放回至加熱器；第五步：在加熱器上孵育3分鐘：牛乳中內(nèi)酰胺酶快速檢測試紙條操作演示深圳易瑞內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓-檢測方法：第六步：3分鐘孵育時間到后，插入內(nèi)酰胺酶試紙條，試紙條孵育3分鐘后肉眼讀取結果或者讀數(shù)儀判定結果：讀數(shù)儀判定：讀數(shù)值0.9為陽性（讀數(shù)必須在實驗結束3分鐘內(nèi)讀取有效） 注意：1.待檢樣大于3個時請用排槍進行轉移以及混勻操作； 2.白色微孔所含為類抗生素，與待檢樣內(nèi)的酶競爭從而通過消 耗掉的抗生素來判斷酶的含量，故白色孔兩步轉回目的是減 少人為消耗類抗生素而造成假陽性。區(qū)分內(nèi)源性與外源性內(nèi)酰胺酶的方法區(qū)分內(nèi)源性與外源性內(nèi)酰胺酶的方法：陽性樣品倍比稀釋獲得臨界陰性奶樣并體外細菌培養(yǎng)法；陽性樣品離心法獲得耐藥菌群添加實驗鑒別法 （詳細方法請咨詢易瑞工程師） 以上兩種方法均得到相關企業(yè)或機構的實驗驗證，是目前唯一能夠區(qū)分內(nèi)源性與外源