d第四章免疫球蛋白課件

1、 第四章 免疫球蛋白 免疫學(xué)教研室武延雋2012（3-5） 概述 1、免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白?？煞譃榉置谛秃湍ば?，前者存在血清中，后者構(gòu)成B細(xì)胞膜上的抗原識別受體。 2、抗體（antibody,Ab)是B細(xì)胞識別抗原后增殖分化為槳細(xì)胞，由槳細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能?？贵w是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都是抗體。第一節(jié) 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)一、免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)（一）四肽鏈結(jié)構(gòu) (重鏈和輕鏈) 所有Ig的基本單位都是四條肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)。1、重鏈（heav

2、y chain H）（每條的分子量約 50-75KD ，由450-550氨基酸殘基組成），根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，其重鏈分別用鏈、鏈、鏈、鏈、鏈，其對應(yīng)的為：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等五類免疫球蛋白，每一類免疫球蛋白又根據(jù)鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵的數(shù)目和位置不同分成不同的亞類，如IgG1 IgG4； IgA可分為IgA1和 IgA2， IgM為IgM1、 IgM2；IgD、IgE未發(fā)現(xiàn)有亞類。FabFcVHCH1CH2CH3VLCLHeavy Chains (five types: Light Chains (two types: andFab fragmentFc

3、 fragmentConstant regionsvariable regionsDisulfide linkages超變區(qū)（ HVR）輕鏈(VL的三個高變區(qū))CDR1 （28-35）CDR2 （49-56）CDR3（ 91-98）重鏈 (VH的三個高變區(qū))CDR1（29-31）CDR2（49-58）CDR3（95-102）框架區(qū)（FR每條鏈有4區(qū)） 高變區(qū)FR2FR1FR2FR3FR4FR1FR3FR4(三) 鉸鏈區(qū) （hinge region） 位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，因此易伸展彎曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，稱作鉸鏈區(qū)。IgM與IgE無鉸鏈區(qū)（四）結(jié)構(gòu)域（功能

4、區(qū) domain）免疫球蛋白分子中，L鏈和H鏈都可折疊形成數(shù)個球形結(jié)構(gòu)叫結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域有一定的功能又叫功能區(qū)，每個結(jié)構(gòu)域的功能不同，但結(jié)構(gòu)相似，約由110個氨基酸組成，其氨基酸的序列具有相似性或同源性，二級結(jié)構(gòu)是反向平行的片層，兩個片層中心有一個鏈內(nèi)二硫鍵垂直連接，形成一個桶狀或三明治，此叫免疫球蛋白折疊（Ig folding）。有桶狀結(jié)構(gòu)的分子統(tǒng)稱為免疫球蛋白超家族。免疫球蛋白分子中，L鏈有兩個結(jié)構(gòu)域（VL、CL）；IgA、IgG、IgD的H鏈有四個結(jié)構(gòu)域（VH、CH1、CH2、CH3）；IgM和IgE有五個結(jié)構(gòu)域（多一個CH4） 功能區(qū)的作用有：VH和VL是結(jié)合抗原的部位；CH和CL上

5、具有部分同種異型的遺傳標(biāo)；IgG的CH2和IgM的CH3具有補(bǔ)體C1q結(jié) 合位點，可啟動補(bǔ)體活化經(jīng)典途徑；IgG可通過胎盤IgG的CH3可結(jié)合細(xì)胞表面的FcRIgE的CH2和CH3可與肥大細(xì)胞和嗜堿性 粒細(xì)胞的IgE Fc受體結(jié)合。二、其他成分1、J 鏈: J鏈?zhǔn)且粭l多肽鏈，富含半胱氨 酸,由漿細(xì)胞合成。2、分泌片: 由黏膜上皮細(xì)胞合成和分泌， 以 非共價形式結(jié)合到二聚體上， 并一起被分泌到黏膜表面。對分 泌型IgA具有保護(hù)作用 三、免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶水解IgG ： 得到兩個相同的Fab段和一個Fc段。胃蛋白酶裂解IgG ： 得到一個具有雙價活性的F（ab）2段和若干個小分子多肽碎

6、片（pFc）木瓜蛋白酶胃蛋白酶第二節(jié)免疫球蛋白的異質(zhì)性一、免疫球蛋白的類型1、類（class）在同一中屬的所有個體內(nèi)Ig重鏈C區(qū)所含抗原表位不同，據(jù)此將重鏈分為五種，對應(yīng)的Ig為IgG IgA IgM IgD和 IgE五類。2、亞類（subclass）同一類免疫球蛋白其重鏈的抗原性及二硫鍵數(shù)目和位置不同依此將Ig分為亞類。IgG1-4個亞類，IgA1-2個亞類IgM1-2個亞類, IgD和 IgE無亞類。3、型（type）Ig輕鏈C區(qū)所含抗原表位不同分為鏈和鏈，對應(yīng)的型和型。4、亞型（subtype）同一型的免疫球蛋白，輕鏈C區(qū)N端氨基酸排列的差異分為亞型， 鏈有4個亞型（ 1 、2 、 3、

7、4 ） 型現(xiàn)無亞型 同種型（isotype)是指同一種屬所有正常個體Ig分子共同具有的抗原特異性標(biāo)志，為種屬型標(biāo)志，同種型決定簇主要存在于Ig恒定（C區(qū)）區(qū)內(nèi)分類： 根據(jù)CH上同種型決定簇的不同，將Ig分為 IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 五類亞類：IgG: G1、 G2、 G3、 G4 IgA: A1、 A2 IgM: IgM1和IgM2 分型： 根據(jù)CL上同種型決定簇的不同：和型亞型： 1、2、3、4FabFcVHCH1CH2CH3VLCL同種型（isotype） 同種異型（Allotype)同一種屬不同個體間Ig分子所具有的不同抗原特異性標(biāo)志，為個體性標(biāo)志，存在于Ig的C 區(qū)。(

8、個體遺傳標(biāo)記)。IgG 鏈的同種異型標(biāo)志是Gm因子，已發(fā)現(xiàn)Gm1-Gm30. IgA 鏈的同種異型標(biāo)志是Am因子，有A2M1和A2M2兩種。 鏈的同種異型標(biāo)志稱為km因子，有km1、km2、km3、獨特型（idiotype)同一個體的不同B細(xì)胞系產(chǎn)生的免疫球蛋白V區(qū)具有不同的免疫原性，叫獨特型，構(gòu)成抗體的特異性獨特標(biāo)志的叫獨特位（獨特型抗原決定簇）。（存在于V 區(qū)的高變區(qū)）,有5-6個獨特位獨特型抗原決定簇、Ig的超變區(qū)和抗原結(jié)合部位立足于同一物質(zhì)結(jié)構(gòu)。是同一物質(zhì)在不同情況下的不同名字獨特型抗原決定簇可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗獨特型抗體（抗抗體），構(gòu)成獨特性網(wǎng)絡(luò)，參與免疫調(diào)節(jié)。第三節(jié) 免疫球蛋白的功能

9、1、識別和特異性的結(jié)合抗原（是V區(qū)特別是CDR的空間構(gòu)型所決定）Ig單體可結(jié)合兩個抗原表位，為雙價抗體 。 （1）B細(xì)胞膜表面的IgM和IgD是B細(xì)胞識別抗原的受體（BCR） （2）抗細(xì)菌感染（結(jié)合細(xì)菌） （3）中和病毒，中和外毒素（結(jié)合病毒和外毒素）2、激活補(bǔ)體 IgM，IgG133、調(diào)理作用、 4、ADCC作用、5、介導(dǎo)型超敏反應(yīng) 6、穿過胎盤7、在黏膜局部起抗感染作用BACKBACK1、IgG于出生后3個月開始合成，3-5歲得到成 人水平。2、IgG多為單體，半衰期約為23天，占血清免 疫球蛋白總量的75%80%3、IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體4、單體形式存

10、在于血清和其它體液中，結(jié)構(gòu)式為： （22或22）一、IgG 第四節(jié) 五類免疫球蛋白的特性與功能5、穿過胎盤 介導(dǎo)新生兒抗感染免疫6、結(jié)合巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的FCR結(jié)合， 起免 疫調(diào)理作用7、與NK細(xì)胞表面的FCR結(jié)合，發(fā)揮ADCC效應(yīng)8、與金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）結(jié)合， 可以純化抗體，也可以用于免疫診斷9、抗感染的主要抗體?？咕贵w、抗病毒 抗體（中和抗體）、抗毒素抗體Immunoglobulin G (IgG)FabFcVHCH1CH2CH3VLCL 二、 IgM1 五聚體形式存在于血液中，5-10%，mg/ml,結(jié)構(gòu)式為（22）5J 或（ 22）5J2 分子量最大，不能穿過血管壁和

11、胎盤3 個體發(fā)育中合成最早的Ig， 臍帶血中IgM增多，提 示可能存在宮內(nèi)感染4 機(jī)體感染后最早出現(xiàn)的Ig是 IgM, 半衰期短。5 天然的血型抗體、類風(fēng)濕因子是IgM。6 B細(xì)胞表面的抗原受體為IgM單體7 結(jié)合和激活補(bǔ)體的能力最強(qiáng)，是5-8價抗體8 調(diào)理吞噬和凝集作用比IgG強(qiáng)Immunoglobulin M (IgM)J-Chain 三、 IgA1、分為兩種類型： 血清型IgA：單體存在于血清中，10-15%，結(jié)構(gòu)式為（22）或（22）。 分泌型IgA（SIgA):含J鏈和分泌片的二 聚體組成，存在于胃腸道和支氣管分泌液、初乳 、唾液和淚液中。2、結(jié)構(gòu)式為：（22）2JSP或（22）2J

12、SP。3、SIgA是參與粘膜局部免疫的主要抗體 4、中和毒素、調(diào)理吞噬 5、生后4-6個月開始產(chǎn)生，4-12歲達(dá)成人水平。6、不能激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑?？杉せ钐娲緩?、不能通過胎盤Immunoglobulin A (IgA)Monomeric- Serum IgA15-20% of serum immunoglobulins2 Heavy and 2 Light 2 Subclasses (IgA1 and IgA2)Found in serumSecretory Immunoglobulin A (sIgA)4 heavy chains and 4 light chains (dimeric

13、)J-Chain and secretory componentThe major immunoglobulin of secretionsNot found in serumSecretory ComponentJ-Chain 四、 IgE1 種系進(jìn)化中最晚出現(xiàn)的Ig，也是血清中含 量最低的Ig2 單體形式存在，結(jié)構(gòu)式為：22或223 結(jié)合肥大細(xì)胞和嗜堿性性粒細(xì)胞，參與I 型超敏反應(yīng)的發(fā)生4 結(jié)合嗜酸性粒細(xì)胞，有效殺傷寄生蟲Immunoglobulin E (IgE)2 Heavy and 2 Light chainsMol. Wt. 190,000 Trace serum proteinN

14、ote CH4 region on H chainAssociated with atopic or anaphylactic hypersensitivityMay play role in immunity to helminthic parasitesCH4五、IgD1、單體形式存在血清中，含量低，僅占 血清總Ig的1%；2、分子結(jié)構(gòu)類似于IgG，但不能通過胎 盤也不能激活補(bǔ)體；結(jié)構(gòu)式為22或223、表達(dá)在B細(xì)胞膜上的smIgD是B細(xì)胞的抗原識 別受體，是成熟B細(xì)胞的重要標(biāo)志，參與B細(xì) 胞的活化、增殖和分化 4、血清中的IgD功能不清Immunoglobulin D (IgD) 2 he

15、avy and 2 light chains1% of serum immunoglobulinsServes as a membrane receptor on B lymphocytesMay play role in antigen-stimulated lymphocyte differentiation第五節(jié) 人工制備抗體一、多克隆抗體(pdyclonal antibody,pAB)（一）概念：抗原物質(zhì)的多個抗原決定簇刺激機(jī)體的產(chǎn)免疫系統(tǒng),體內(nèi)多個B細(xì)胞克隆被激活,產(chǎn)生針對多種不同抗原表位的免疫球蛋白(抗體)的混合物.（二）多克隆抗體的應(yīng)用 1、免疫學(xué)檢測 2、被動免疫治療 3、緊急

16、預(yù)防 （三）存在問題 特異性差, 用于免疫學(xué)檢測容易出現(xiàn)交叉反應(yīng) 二、單克隆抗體 monoclonal antibody，mAb 單一種抗原表位, 激活一個B細(xì)胞克隆,產(chǎn)生針對單一抗原決定簇（表位）的高純度的抗體。（一）.概念: 通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.（二）.B細(xì)胞雜交瘤的類型 小鼠-小鼠 大鼠-大鼠 小鼠-人 人-人（三）、制備過程制備單克隆抗體的方法與原理1、免疫動物，制備脾細(xì)胞2、選用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶的瘤細(xì)胞變異株(PEG聚乙二醇)與脾臟的B細(xì)胞融合3、HAT選擇性培養(yǎng)基（次黃嘌呤：HyPoxant

17、hine H；氨基喋呤：Aminoopterin A；胸腺嘧啶核苷Thymidine T）4、在這種選擇性培養(yǎng)基中，變異的瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細(xì)胞不可避免要死亡。5、融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被篩選出來6、B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長期生長一般于二周內(nèi)均死亡。7、通過有限稀釋篩選出能夠產(chǎn)生特異性抗體的

18、雜交瘤細(xì)胞，然后注射小鼠的腹腔，使瘤細(xì)胞增殖，產(chǎn)生特異性抗體。取免疫小鼠的脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞在PEG(聚乙二醇)作用下細(xì)胞融合融合脾細(xì)胞+瘤細(xì)胞；未融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到HAT培基瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，未融合的瘤細(xì)胞死亡B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長期生長，一般于二周內(nèi)均死亡。 融合的雜交瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，雜交瘤細(xì)胞大量繁殖，被篩選出來稀釋篩選特異性抗體的雜交

19、瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔生長產(chǎn)生抗體雜交瘤技術(shù)過程（四）單克隆抗體與常規(guī)抗體相比的優(yōu)點單一特異性，與一個抗原決定簇反應(yīng)； 可重復(fù)性，能夠提供完全一樣的抗體制劑一經(jīng)制出，可無限量地供應(yīng)；生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。 單克隆抗體的特性 高度均一性： 純度很高的均一性抗體 高度專一性： 只對抗原分子上某一抗原決定 簇起反應(yīng) 可大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性： 雜交瘤細(xì)胞能在體內(nèi)外無限繁殖之傳代 （五）單克隆抗體在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1、用作診斷試劑 （ 1）檢測淋巴細(xì)胞表面分子，區(qū)分不同分化 階段的淋巴細(xì)胞，鑒別淋巴細(xì)胞。 （2）鑒定病原體，準(zhǔn)確診斷傳染病。 （3）用于腫瘤

20、的診斷和分型 （4）激素類單抗用于測定體內(nèi)激素含量，判 斷內(nèi)分泌的功能狀態(tài)2、用作研究工具（1）純化抗原（2）分析和探查抗原結(jié)構(gòu)（3）分析抗原決定簇分子的功能3、用于疾病的治療（1）抗細(xì)胞表面分子單抗，用于移植排斥反應(yīng)的防治（2）抗細(xì)胞因子單抗用于自身免疫性疾病的治療（3）抗腫瘤單抗用于腫瘤的導(dǎo)向治療4、單克隆抗體用于免疫治療存在的問題（1）單克隆抗體的特異性 由于腫瘤特異性抗原較少，缺乏對腫瘤有嚴(yán)格特異性的單抗，對正常組織有交叉反應(yīng)（2）異種抗體反應(yīng) 鼠源性單抗用于人體，導(dǎo)致異源性超敏反應(yīng)三、基因工程抗體(Genetic engineering antibody)概念： 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生的新型抗體，叫基因工程抗體。主要包括： 嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。1. 嵌合抗體(chimeric antibody) 從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體。 特點：減少了