對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能保健品規(guī)范課件

1、對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用的保健品對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用的保健品化學(xué)性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類化學(xué)毒物損傷肝臟的機(jī)理具有保肝作用的功能食品對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用檢驗(yàn)方法化學(xué)性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類化學(xué)毒物損傷肝臟的機(jī)理具有?；瘜W(xué)性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類定義：是由化學(xué)性肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷。分類：根據(jù)毒性的強(qiáng)弱, 這些親肝毒物可分為三類： 1. 劇毒類：包括磷、三硝基甲苯、四氯化碳、氯奈、丙烯醛等。 2.高毒類：砷、汞、銻、苯胺、氯仿、呻化氫、二甲基甲酰胺等。 3.低毒類：二硝基酚、乙醛、有機(jī)磷、丙烯晴、鉛等。化學(xué)性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類定義：是由化學(xué)性肝毒性物質(zhì)

2、所化學(xué)毒物損傷肝臟的機(jī)理1.脂肪變性。四氯化碳、黃磷等可干擾脂蛋白的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)，形成脂肪肝。2.脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，這是中毒性肝損傷的特殊表現(xiàn)形式，如四氯化碳在體內(nèi)代謝產(chǎn)生一種氧化能力很強(qiáng)的中間產(chǎn)物，導(dǎo)致生物膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞膜的磷脂，改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能。3.膽汁郁積反應(yīng)，主要與肝細(xì)胞膜和微絨毛受損，引起膽汁酸排泄障礙有關(guān)。化學(xué)毒物損傷肝臟的機(jī)理1.脂肪變性。四氯化碳、黃磷等可干擾脂對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能保健品規(guī)范課件對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能保健品規(guī)范課件具有保肝作用的功能食品 目前我國(guó)已經(jīng)研制開(kāi)發(fā)的, 經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用的保健食品共有322種,

3、 最新批準(zhǔn)的對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用的保健品是北京世紀(jì)合輝醫(yī)藥科技有限公司開(kāi)發(fā)的合輝牌和泰粉。主要原料葛根提取物、黨參提取物、枳椇子提取物、紅景天提取物、葡萄糖。 標(biāo)志性成分是葛根素。批準(zhǔn)日期 是2012年9月18 日，批準(zhǔn)文號(hào)是國(guó)食健字G20120362 。 具有保肝作用的功能食品 目前我國(guó)已經(jīng)研制開(kāi)發(fā)我國(guó)具有保肝作用的功能食品的分類 根據(jù)主要功效成分和保健作用, 大致分為以下四類。 1.由中草藥或其提取物研制而成。 如靈芝、大豆、枸杞、茶、黃芪、蘆筍、當(dāng)歸、山楂、銀杏、香菇等。這類植物具有活血化瘀的、清肝解毒、強(qiáng)肝益肝的作用, 從有效成分來(lái)看, 這些保健食品中含有多糖、黃酮類、甙類及萜類化

4、合物,如大豆皂甙、銀杏黃酮類、香菇多糖、黃芪多糖等, 具有提高免疫能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗腫瘤、抗衰老等生物功能。我國(guó)具有保肝作用的功能食品的分類 根據(jù)主要 2.目前公認(rèn)的具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增 殖、提高免疫能力的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 如牛磺酸、硒、維生素E、維生素C 等; 維生素E 和硒都是自由基清除劑,大劑量Vc能減輕細(xì)胞脂肪性病變, 促進(jìn)肝細(xì)胞再生及肝糖元的合成, 增強(qiáng)肝臟的解毒功能。因此, 對(duì)肝炎或肝性昏迷者, 大劑量V c確有治療作用。 2.目前公認(rèn)的具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增 3.由一些特殊動(dòng)物如牡蠣、毛蟲(chóng)甘苦參、甲魚(yú)、螞蟻等研制而成。 4.一些特殊生物因子如胎盤(pán)因子、多肽等。 谷胱甘肽( GSH)

5、 能與進(jìn)入體內(nèi)的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合, 并促其排出體外, 起到中和解毒的作用。GSH 還可抑制乙醇侵害肝臟產(chǎn)生脂肪肝。 3.由一些特殊動(dòng)物如牡蠣、毛蟲(chóng)甘苦參、甲對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能保健品規(guī)范課件對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能保健品規(guī)范課件對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能保健品規(guī)范課件酒前酒后舒肝片【功效成份及含量】: 粗多糖 190mg ，梔子甙 461.54mg【主要原料】枸杞子、梔子、茯苓、丹參【適宜人群】有化學(xué)性肝損傷危險(xiǎn)者【不適宜人群】少年兒童【衛(wèi)生許可證】GD.FDA健證字2006第5100S0267號(hào)酒前酒后舒肝片【品名】同仁堂牌警醒片【主要原料】L-谷氨酰胺

6、、?；撬?、維生素C、;-肉堿酒石酸鹽、葡萄糖酸鋅、碳酸鎂、維生素B1、葡萄糖、硬脂酸鎂【標(biāo)志性成分及含量】每100g含：?；撬?0.1g、維生素C6.86g、L-肉堿4.58g【保健功能】對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用【適宜人群】有化學(xué)性肝損傷危險(xiǎn)者【品名】同仁堂牌警醒片產(chǎn)品成分?；撬?保護(hù)肝細(xì)胞、降低血清轉(zhuǎn)氨酶；L-谷氨酰胺-減少和對(duì)抗自由基對(duì)肝臟的損害；L-肉堿酒石酸鹽(BT)-補(bǔ)充酒精影響肝臟后合成不足，并修復(fù)損傷肝細(xì)胞；維生素B1-預(yù)防酒精性腦??；碳酸鎂-能改善酒精引起的精神障礙；維生素-C抗氧化、參與肉堿生物合成保護(hù)肝細(xì)胞；葡萄糖酸鋅-拮抗肝細(xì)胞凋亡；葡萄糖-加快體內(nèi)酒精的分解速度，避

7、免造成酒精中毒。產(chǎn)品成分對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能食品評(píng)價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果判定1.試驗(yàn)項(xiàng)目 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為方案一（四氯化碳肝損傷模型）和方案二（酒精肝損傷模型）兩種。 方案一（四氯化碳肝損傷模型） 體重 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT） 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST） 肝組織病理學(xué)檢查 對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能食品評(píng)價(jià)試驗(yàn)項(xiàng)目、試驗(yàn)原則及結(jié)果 方案二（酒精肝損傷模型） 體重 丙二醛（MDA） 還原型谷胱甘肽（GSH） 甘油三酯（TG） 肝組織病理學(xué)檢查 方案二（酒精肝損傷模型）2.試驗(yàn)原則 （1）所列指標(biāo)均為必做項(xiàng)目。 （2）根據(jù)受試樣品作用原理的不同，方案一和方案二任選其一進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 2.試驗(yàn)原則

8、3.結(jié)果判定 方案一（四氯化碳肝損傷模型）:病理結(jié)果陽(yáng)性，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶二指標(biāo)中任一項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能作用。 方案二（酒精肝損傷模型）:肝臟MDA、GSH、TG三項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品對(duì)乙醇引起的肝損傷有輔助保護(hù)功能， 肝臟MDA、GSH、TG三指標(biāo)中任二項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性，且肝臟病理結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有對(duì)乙醇引起的肝損傷有輔助保護(hù)功能作用。3.結(jié)果判定對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用檢驗(yàn)方法方案一：四氯化碳肝損傷模型 1.原理 四氯化碳(CCl4)受到肝微粒體酶活化成為三氯甲烷自由基(CCl3)與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致蛋白合成障礙、脂質(zhì)分

9、解代謝紊亂，引起肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)蓄積。CCl3也能迅速與O2結(jié)合轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化三氯甲烷自由基(CCl3O2)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，從而引起細(xì)胞膜的變性損傷,致使酶滲漏以及各種類型的細(xì)胞病變，甚至壞死。對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用檢驗(yàn)方法方案一：四氯化碳肝損傷模 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年大鼠或小鼠，單一性別，大鼠（180220克），每組8-12只，小鼠（1822克），每組10-15只。 3.實(shí)驗(yàn)方法和步驟 3.1 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間 實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組和一個(gè)模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組。用CCl4（分析純）造成肝損傷模型

10、，造模方式可以灌胃或腹腔注射。小鼠CCl4灌胃濃度為1，以食用植物油稀釋，灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為80 mg/kgBW)，大鼠CCl4灌胃濃度為23%，灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為160240 mg/kgBW)。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為80 mg/kgBW)，大鼠CCl4灌胃濃度為23%，灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為160240 mg/kgBW).必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天. 3.2 給予受試樣品的途徑 經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無(wú)法灌胃時(shí)將受試樣品摻入飼料或飲

11、水亦可，并記錄每只動(dòng)物的飼料攝入量或飲水量。 灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為80 mg/3.3實(shí)驗(yàn)步驟 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水。將動(dòng)物每周稱重兩次，以調(diào)整受試樣品劑量。于實(shí)驗(yàn)第30天將各組動(dòng)物隔夜禁食16小時(shí)，模型組及各樣品組一次灌胃給予CCl4，空白對(duì)照組給植物油，受試組繼續(xù)給予受試樣品至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（與CCl4灌胃間隔4小時(shí)以上）。給予CCl4 后，根據(jù)實(shí)際情況于 24或48小時(shí)處死動(dòng)物，取血分離血清，測(cè)定ALT、AST，并取肝臟進(jìn)行病理組織學(xué)檢測(cè)。3.3實(shí)驗(yàn)步驟 3.4 檢測(cè)指標(biāo) 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），肝臟病理組織檢

12、查 4. 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）,谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的測(cè)定 4.1 測(cè)定方法 可選用全自動(dòng)生化分析儀或賴氏法（試劑盒）測(cè)定。 3.4 檢測(cè)指標(biāo) 4.2 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。受試樣品組的ALT、AST與模型對(duì)照組比較，差異有顯著性，可分別判

13、定ALT、AST結(jié)果陽(yáng)性。 4.2 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 5. 肝臟病理組織學(xué)變化、診斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果判定 5.1 實(shí)驗(yàn)材料 取大鼠肝臟左葉用10%福爾馬林固定，從肝左葉中部做橫切面取材，常規(guī)病理制片（石蠟包埋，H.E染色）。 5.2 鏡檢 從肝臟的一端視野開(kāi)始記錄細(xì)胞的病理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個(gè)組織切片。可見(jiàn)小葉中心性肝細(xì)胞的退行性病變和少數(shù)細(xì)胞壞死。主要病變類型有肝細(xì)胞氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、肝細(xì)胞水樣變性和細(xì)胞壞死等。 5. 肝臟病理組織學(xué)變化、診斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果判定 5.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 分別記錄每個(gè)視野中的各種病變所占視野的面積，并累計(jì)所觀察視野的病變總分。 肝細(xì)胞氣球樣變,（細(xì)胞

14、腫大,胞漿殘留少許） 5.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 肝細(xì)胞脂肪變性：（肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)界限清晰脂滴空泡） 肝細(xì)胞脂肪變性：（肝細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)界限清晰脂滴空泡）胞漿凝聚：（胞漿嗜伊紅增強(qiáng)）胞漿凝聚：（胞漿嗜伊紅增強(qiáng)）水樣變性：水樣變性：肝細(xì)胞壞死：（胞漿嗜伊紅變，凝固性壞死）肝細(xì)胞壞死：（胞漿嗜伊紅變，凝固性壞死） 5.4 數(shù)據(jù)處理和病理結(jié)果判定 采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差

15、齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 5.4 數(shù)據(jù)處理和病理結(jié)果判定 （1）受試樣品任何一個(gè)劑量組與模型對(duì)照組之間，氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、水樣變性或肝細(xì)胞壞死等肝細(xì)胞病變中，肝細(xì)胞壞死程度減輕，差異有顯著性，而其它病變類型與模型對(duì)照組比較明顯減輕或無(wú)明顯差異，可判斷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果陽(yáng)性。 （2）受試樣品任何一個(gè)劑量組與模型對(duì)照組之間，氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、水樣變性這四種肝細(xì)胞病變類型加重和減輕同時(shí)存在，差異有顯著性，且肝細(xì)胞壞死程度減輕，差異有顯著性，則可將其各種病理變化的得分相加，肝細(xì)胞壞死評(píng)分2倍計(jì)入，以總分進(jìn)行統(tǒng)

16、計(jì)分析，若差異有顯著性，可判斷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果陽(yáng)性。 （1）受試樣品任何一個(gè)劑量組與模型對(duì)照組之間， 6 結(jié)果判斷 在模型成立的前提下，ALT、AST兩項(xiàng)血液生化指標(biāo)果為中任何一項(xiàng)和病理結(jié)陽(yáng)性，可判定受試樣品對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用。 方案二：酒精肝損傷模型 1.原理 機(jī)體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，使三羧循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積。同時(shí)乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。 6 結(jié)果判斷 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年小鼠或大鼠，單一性別，大鼠（180220克），每組8-12只，小鼠（1822克）

17、，每組10-15只。 3. 實(shí)驗(yàn)方法和步驟 3.1 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間 實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組和一個(gè)模型對(duì)照組，以人體推薦量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)二個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 用無(wú)水乙醇（分析純）造成肝損傷模型，無(wú)水乙醇濃度為50（以蒸餾水稀釋），小鼠灌胃量1214mL/kgBW (折合乙醇的劑量為60007000 mg/kgBW)。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天。 3.2 給予受試樣品的途徑 經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無(wú)法灌胃時(shí)將受試樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動(dòng)物的飼料攝入量或飲水量。 3.3 檢測(cè)指標(biāo)

18、肝組織中丙二醛（MDA） 還原型谷胱甘肽（GSH） 甘油三酯（TG）的含量。 用無(wú)水乙醇（分析純）造成肝損傷模型，無(wú)水乙醇濃度為50 3.4 實(shí)驗(yàn)步驟 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水。將動(dòng)物每周稱重兩次，以調(diào)整受試樣品劑量。給予受試樣品結(jié)束時(shí)將模型對(duì)照組及各樣品組一次灌胃給予50%乙醇12mL/kgBW，空白對(duì)照組給蒸餾水，禁食16小時(shí)處死動(dòng)物，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)及病理組織學(xué)檢查。 3.4 實(shí)驗(yàn)步驟 4 肝勻漿中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）測(cè) 定方法 4.1 原理 MDA (malondiadehycle) 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，檢測(cè)其含量可間接估計(jì)

19、脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。MDA與硫代巴比妥酸在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物，吸收峰在535nm,具此可測(cè)得MDA的含量 4.2 儀器與試劑 儀器 721分光光度計(jì)、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機(jī)、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器 4 肝勻漿中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）測(cè) 試劑 0.2M乙酸鹽緩沖液 PH3.5 0.2M乙酸溶液 185mL 0.2M乙酸鈉溶 15mL 1mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，4保存3個(gè)月），臨用前用水稀釋成40nmol/mL 8.1%十二烷基硫酸鈉SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA 0.2M磷酸鹽緩沖液 PH7.4 0.2M磷酸氫二鈉 1920mL0.2M 磷

20、酸二氫鉀 480mL 試劑 4.3 實(shí)驗(yàn)步驟 4.3.1 樣品制備 組織勻漿樣品：取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復(fù)進(jìn)行3次，制成5組織勻漿（W/V），3000r/min離心510min，取上清液待測(cè)。 4.3.2樣品測(cè)定(見(jiàn)下一頁(yè)表) 4.3 實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能保健品規(guī)范課件4.3.3計(jì)算過(guò)氧化脂質(zhì)含量（nmol/mg組織）=過(guò)氧化脂質(zhì)含量(nmol/100mg蛋白質(zhì))= A: 空白管吸光度B：樣品熒吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)

21、K：稀釋倍數(shù)4.3.3計(jì)算 4.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果判定 在模型成立的前提下，受試樣品組的MDA含量與模型對(duì)照組比較，差異有顯著性，判定該指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。 4.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定 5 肝勻漿還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定

22、方法 5.1 原理 GSH和5,5-二硫?qū)ο趸姿幔―TNB）反應(yīng)在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰離子，于423nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，測(cè)定該離子濃度，即可計(jì)算GSH的含量。 5.2 試劑 5.2.1 0.9生理鹽水 5.2.2 4磺基水楊酸溶液 5.2.3 0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0)： Na2HPO4 13.452g KH2PO4 0.722g 加蒸餾水至1000mL。 5 肝勻漿還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定方法 5.2.4 0.004DTNB溶液： 稱取DTNB 40mg溶于1000mL的0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0)中。 5.2.5 疊

23、氮納緩沖液 NaN3 16.25 mg EDTA-Na2 7.44 mg Na2HPO4 1.732 g NaH2PO4 1.076 g 加蒸餾水至1000mL，用少量HCl、NaOH調(diào)pH7.0，4保存。 5.2.4 0.004DTNB溶液：5.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取還原型GSH 15.4mg，加疊氮納緩沖液至50mL，終濃度為 1mmol/L，臨用前配制。5.3 方法5.3.1 樣品測(cè)定： 取肝臟0.5g加生理鹽水5mL充分研磨成細(xì)漿（10%肝勻漿），混勻后取漿液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3000rpm離心10分鐘，取上清液即為樣品。樣品測(cè)定管中加4.5mLDTNB

24、，空白管加0.5mL4%磺基水和4.5mLDTNB混勻，室溫放置10 分鐘后，412nm處測(cè)定吸光度。5.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液：5.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 5.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 5.3.3 計(jì)算 樣品GSH含量 (mol /g肝重) = 對(duì)應(yīng)曲線濃度值 (mol/L) 50g/L 5.4 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；

25、若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果判定 在模型成立的前提下，受試樣品組的還原型GSH含量與模型對(duì)照組比較，差異有顯著性，判定該指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。 5.3.3 計(jì)算 2.6 肝勻漿中甘油三酯（TG）測(cè)定方法 2.6.1 測(cè)定方法：采用甘油三酯測(cè)定試劑盒（甘油磷酸氧化酶過(guò)氧化物酶法）測(cè)定10%肝勻漿中的甘油三酯含量。與血清甘油三酯測(cè)定方法相同，以等量10%肝勻漿替代血清按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定結(jié)果以mmol/g肝重表示。 2.6.2 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異

26、無(wú)顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 2.6 肝勻漿中甘油三酯（TG）測(cè)定方法 在模型成立的前提下，受試樣品組的TG與模型對(duì)照組比較，差異有顯著性，判定該指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。 7 肝臟病理組織學(xué)變化、診斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果判定 7.1 實(shí)驗(yàn)材料：從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，蘇丹染色，。 7.2 鏡檢：從肝臟的一端視野開(kāi)始記錄細(xì)胞的病理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個(gè)組織切片。主要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積。 在模型成立的前提下，受試樣品組的TG與模型對(duì)照 7.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 7.3 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 7.4