現(xiàn)代儀器分析：第三章 高效液相色譜

第三章高效液相色譜HighPerformance

LiquidChromatography本章內(nèi)容：高效液相色譜概述高效液相色譜儀高效液相色譜的分類高效液相色譜分析方法高效液相色譜儀的維護與保養(yǎng)高效液相色譜商品儀器及廠商

一、概述概念特點應(yīng)用

高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)一般指采用高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏檢測器等儀器裝置，具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度高和應(yīng)用范圍廣的一類液相色譜分析方法。高效液相色譜和經(jīng)典液相色譜的比較

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）色譜柱流動相的推動力檢測方式

粗粒多孔固定相，大口徑、長玻璃柱管全多孔微粒固定相，小口徑，短不銹鋼柱管

HPLC依靠重力讓溶劑流下，分離速度慢，分析時間長(1～20h)

采用高壓泵輸送流動相，可準確控制流速，分析速度快(0.05～1h)HPLC用于混合物的分離，一般分離和檢測過程獨自將柱分離技術(shù)與光學(xué)檢測器聯(lián)用，使得液相色譜從最初的以分離目的為主，發(fā)展為可以同時完成分離分析

HPLC

高效液相色譜適用于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機化合物；生物活性物質(zhì)和天然產(chǎn)物；合成和高分子化合物，以及無機和有機離子型化合物。在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)，核堿、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物質(zhì)的純化和分析。藥物分析

合成藥物的純化及質(zhì)量控制，中草藥有效成分的分離、制備及純度測定以及臨床醫(yī)學(xué)的藥代動力學(xué)研究中的分離分析。除聚合物外,約80%的藥物都能用高效液相色譜進行分離和純化。特別是手性藥物的分離分析。高效液相色譜法測定野蕨菜氨基酸成分

色譜條件：ShimpackCLCCN色譜柱，(150mm×6.0mm,5μm)，流動相：正己烷-乙醇-甲醇(87.8∶10.2∶2,V/V/V)；流速1.10mL·min-1；檢測波長240nm；柱溫40℃。

同時測定人血漿中地西泮、硝西泮、氯硝西泮、咪達唑侖、三唑侖、艾司唑侖和阿普唑侖7種藥物的濃度磺酸酯在HPLC上的手性分離食品分析

①食品本身組成,特別是營養(yǎng)成分，如糖、有機酸、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加劑，如防腐劑、抗氧化劑、合成色素、甜味劑和保鮮化學(xué)物質(zhì)的分析；③食品污染物，如農(nóng)藥殘余和黃曲霉素等的分析同時測定鰻魚中磺胺嘧啶（ＳＤ）、磺胺甲基嘧啶（ＳＭ１）、磺胺二甲嘧啶（ＳＭ２）、磺胺甲氧嗪（ＳＭＰ）、磺胺甲噁唑（ＳＭＺ）、磺胺間甲氧嘧啶（ＳＭＲ）、磺胺間二甲氧嘧啶（ＳＤＭ）、磺胺喹噁啉（ＳＱＸ）8種磺胺類藥物環(huán)境監(jiān)測

該法特別使用于分子量大,揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的有機污染物的分離和分析。如多環(huán)芳烴、酚類、多氯聯(lián)苯、鄰苯二甲酸酯類、聯(lián)苯胺類、陰離子和非離子表面活性劑、有機農(nóng)藥等。圖1十六種PAH標(biāo)樣的HPLC紫外譜圖圖2十六種PAH標(biāo)樣的HPLC熒光譜圖以標(biāo)準譜圖相對照。圖1和圖2為十六種PAH標(biāo)樣在ZorbaxODS柱的HPLC圖，出峰順序為1.萘，2.苊烯，3.苊十芴，4.菲，5.蒽，6.熒蒽，7.芘，8.苯并(a)蒽十枹，9.苯并(b)熒蒽，10.苯并(k)熒蒽，11.苯并(a)芘，12.二苯并(a，h)蒽，13.苯并(ghi)苝，14.茚并(1,2,3-cd)芘。

水質(zhì):多環(huán)芳烴的測定

精細化工產(chǎn)品分析

具有較高分子量和較高沸點的有機化合物，如高碳數(shù)脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各種表面活性劑、藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等化工產(chǎn)品

制備分離應(yīng)用

在許多科學(xué)研究和生產(chǎn)領(lǐng)域，往往需要制備或提取一些高純化合物。

色譜過程是一特殊的動態(tài)多次重復(fù)分離過程：從進樣閥引入的樣品組分被流動相帶入色譜柱。由于不同組分與流動相和固定相的分子間作用力不同，它們在色譜柱的移動速度不同，先后流出色譜柱進入檢測器。由檢測器記錄分離過程--色譜圖。1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置在線脫氣機色譜泵及控制器進樣器檢測器數(shù)據(jù)處理及控制色譜柱流動相脫氣裝置目的：使色譜泵的輸液準確—脈動減少；保留時間及色譜峰面積重現(xiàn)性提高提高檢測性能—防止氣泡引起的尖峰；基線穩(wěn)定保護色譜柱—減少死體積；防止填料的氧化惰性氣體脫氣法：向溶劑中吹入氦氣等小分子氣體，以使溶解在流動相中的空氣等氣體脫出。超聲波脫氣法：將溶劑瓶置于超聲波清洗槽中，以水為介質(zhì)超聲脫氣，一般500mL流動相超聲20～30min。此法方便，不影響流動相的組成，適用于各種流動相脫氣。抽真空：溶劑抽濾在線脫氣：可保持連續(xù)脫氣。（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：高壓輸液系統(tǒng)：一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。要求：泵體材料能耐化學(xué)腐蝕。能在高壓下連續(xù)工作。通常要求耐壓40～50MPa·cm-2。輸出流量范圍寬。一般為0.1～10mL/min。輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高。流量控制的精密度應(yīng)小于1%等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）類似GC的等溫度洗脫梯度洗脫（類似的GC程序升溫）梯度洗脫指采用兩種（或多種）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)變化流動相組成比和極性的一種洗脫模式。對于復(fù)雜混合物，特別是保留性能相差較大的混合物的分離梯度洗脫是一種極為重要的手段。特點（1）改善分離,加快分析速度；

（2）改善峰形,減少拖尾,有利于痕量組分的檢測

梯度洗脫進樣系統(tǒng)：不使整個壓力變化的情況下將樣品注入色譜柱高效液相色譜儀采用閥進樣方式。分手動進樣和自動進樣

1）液相色譜進樣針：平頭，25、50和100μl等

2）閥進樣（環(huán)路進樣器）

進樣量大小通過選擇不同體積（1～100μl）的定量管決定。當(dāng)進樣閥手柄置于“取樣（load）”位置時，用特制的平頭注射器將樣品液注入取樣管。再將進樣閥手柄轉(zhuǎn)向“進樣（inject）”位置時，流動相將樣品掖攜帶進入色譜柱進行分離。3）自動進樣器在程序控制器或計算機控制下可自動完成取樣、進樣、清洗等一系列操作，一次可進行幾十個或上百個樣品的分析。自動進樣裝置分離系統(tǒng)：色譜柱

包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達25mm以上。

操作注意：流動相的轉(zhuǎn)換流速的變化幅度溫度變化幅度專用色譜柱：樣品及溶劑的要求有機——有機溶劑：直接轉(zhuǎn)換有機——緩沖溶液：用純水過渡記?。耗玫揭桓轮欢ㄒ瓤词褂谜f明檢測器：利用被測物的某一物理或化學(xué)性質(zhì)與流動相有差異的原理，當(dāng)被測物從色譜柱上流出時，會導(dǎo)致流動相背景值發(fā)生變化，從而在色譜圖上以色譜峰形式表現(xiàn)出來。

幾種主要檢測器的基本特性紫外吸收檢測器（UV-VIS）

具有靈敏度高，線性范圍寬，對流動相基本無響應(yīng)，對流速和溫度不敏感等特點，它是液相色譜最常用的檢測器。固定波長型：光源波長固定，一般為254nm，簡單、靈敏?？勺儾ㄩL型：常規(guī)氘燈（紫外光源）的使用范圍195～400nm掃描型或二極管陣列：可以瞬間實現(xiàn)紫外可見光區(qū)的全波長掃描，得到時間－波長－吸收強度三維色譜圖。樣品池

紫外檢測的主要參數(shù)是選擇檢測波長

應(yīng)考慮溶質(zhì)和流動相的吸收特性：常選擇被測物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長作檢測波長，但為了選擇性或其他目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長；應(yīng)盡可能選擇檢測波長下沒有背景吸收的流動相示差折光檢測器（refractiveindex，RX）通過連續(xù)監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測定溶質(zhì)濃度。折射率是物質(zhì)的通用性質(zhì)，示差折射檢測器是一種通用型的整體性質(zhì)檢測器

折射率對溫度的變化非常靈敏，檢測器必須恒溫

靈敏度較低，不能用于梯度洗脫。熒光檢測器（fluorescencedetector，F(xiàn)LD）它用于檢測物質(zhì)本身具有熒光或為了提高靈敏度將無熒光的物質(zhì)衍生成熒光體?？捎脽晒鈾z測的物質(zhì)：如某些代謝物、食品、藥物、氨基酸、多肽、胺類、維生素、石油高沸點餾分、生物堿和甾族化合物等熒光檢測器是一種很靈敏的,有選擇性的檢測器,其靈敏度比UV高10~1000倍,一般可測ppb級的化合物電化學(xué)檢測器（electrochemicaldetector，ECD）對于具有電活性的物質(zhì),在液相色譜中可采用電化學(xué)檢測器檢測。它包括電導(dǎo)庫侖、安培、極譜、電位和光電導(dǎo)等形式；具有高選擇性、高靈敏度、低造價等優(yōu)點。聯(lián)用檢測器液相色譜儀與質(zhì)譜聯(lián)用與紅外光譜儀聯(lián)用與核磁共振聯(lián)用與原子吸收、原子發(fā)射光譜儀聯(lián)用等

工作站所有分析過程都可在線模擬顯示，數(shù)據(jù)自動采集、處理和存儲，并對整個分析實現(xiàn)自動控制。

Millennium32處理軟件一、按分離過程的物理化學(xué)原理分類

吸附色譜(AdsorptionChromatography)分配色譜（PartitionChromatography）離子交換色譜（IonExchangerChromatography）空間排阻色譜（SizeExclusionChromatography）親合色譜（AffinityChromatography）二、按實際應(yīng)用色譜類型分類

正相色譜與反相色譜離子對色譜離子交換色譜和離子色譜空間排阻色譜手性色譜電色譜等三、分離類型的選擇吸附色譜(AdsorptionChromatography)用固體吸附劑作固定相，以不同極性溶劑作流動相，樣品中各組分依據(jù)它們在吸附劑上吸附力的大小來進行分離的色譜方法

流動相

活性吸附點

固定相

液固吸附色譜分配色譜（PartitionChromatography）

用載帶在固相基體上的固定液作固定相，以不同極性溶劑作流動相，樣品中各組分依據(jù)它們在固定液中溶解能力大小，即在固定相和流動相間的分配系數(shù)大小來進行分離的色譜方法。

液液分配色譜

離子交換色譜

（IonExchangerChromatography）用離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動相，樣品中各離子組分依據(jù)它們與離子交換劑上荷電交換基團的交換能力大小來進行分離的色譜方法。

離子交換色譜

空間排阻色譜（SizeExclusionChromatography）

用化學(xué)惰性多孔物質(zhì)作固定相，樣品中各組分依據(jù)它們在流動相的分子體積大小來進行分離的色譜方法。以水溶液作流動相的排阻色譜稱為凝膠過濾色譜（GelFitrationChromatography）；以有機溶劑作流動相的排阻色譜稱為凝膠滲透色譜（GelPermeationChromatography）。

排阻色譜親合色譜（AffinityChromatography）

用固相基體上固載化生物特異性吸附的配位體作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動相，樣品中各生物活性分子組分依據(jù)它們與固相基體上固載的配位體之間的特異親合力大小來進行分離的色譜方法

親合色譜正相色譜與反相色譜

正相色譜（NormalPhaseChromatography）

固定相的極性大于流動相的極性，適于分離油溶性或水溶性的極性和強極性化合物

。依據(jù)溶質(zhì)分子的極性大小進行分離。溶質(zhì)分子與固定相的極性基團產(chǎn)生特異的極性相互作用，極性作用大小決定的保留時間大小

反相色譜（ReversedPhaseChromatography）

固定相的極性小于流動相的極性，適于分離非極性、極性或離子型化合物，應(yīng)用范圍比正相廣（約80％分析任務(wù)）。依據(jù)溶質(zhì)分子的疏水性大小進行分離。溶質(zhì)分子疏水基與疏水固定相產(chǎn)生非特異的疏水相互作用，疏水作用大小決定的保留時間大小。反相色譜中常用含水乙腈、甲醇和四氫呋喃的流動相。離子對色譜

（Ion-pairchromatogaphy）離子抑制技術(shù)

降低流動相的酸度，離解增大，造成保留降低；增大流動相的酸度，抑制弱酸離解，保留時間增大。調(diào)節(jié)流動相的pH大小，抑制離子離解，可使弱酸或弱堿的有機物在反相柱上得到較好的保留反相離子對色譜流動相添加"離子對試劑"，使得難保留的樣品離子與離子對試劑形成中性離子對締合物，增加它們在反相柱上的保留能力。不同的樣品離子,形成離子對的能力不同，導(dǎo)致它們在色譜柱的保留時間不同。大多數(shù)可離解的化合物在液固色譜分離時，強烈的吸附在硅醇基上,造成保留時間太大,甚至不能流出色譜柱,或者嚴重拖尾,柱效很低。同樣，離子型化合物在反相色譜中也難于保留。采用離子抑制技術(shù)或離子對色譜方法可對它們進行分離分析。通常應(yīng)用于酸和堿混合物的分離及金屬螯合物的分離。離子色譜離子交換色譜離子交換色譜是一種以離子交換劑為固定相，用來分離分析陽離子和陰離子的液相色譜法，其分離原理是溶質(zhì)離子和流動相中的抗衡離子間與離子交換劑上的固定離子點位的親合競爭。

凡是在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都能用離子交換色譜進行分離，它不僅適用于無機離子混合物的分離，也可用于有機物的分離，特別是氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的分析。一般采用含鹽的水溶液作流動相，流動相選擇應(yīng)滿足：能夠溶解各種鹽并提供離子交換必需的緩沖液具有合適的離子強度以便控制樣品離子的保留值對被分離的對象有選擇性

空間排阻色譜

(SizeExclusionChromatography,SEC)根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸(分子量、有效體積、流體力學(xué)體積)的差別進行分離的。排阻色譜的應(yīng)用范圍廣泛，特別是在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域,可用于分離那些因溶解度、極性吸附或離子特性無足夠差異的,分子量在10~106這樣一個寬范圍的大分子混合物排阻色譜（凝膠色譜）：凝膠滲透色譜(GPC)：以有機溶劑為流動相凝膠過濾色譜(GFC)：以水為流動相的凝膠色譜手性色譜手性化合物在生命科學(xué)中占有十分重要的位置，特別是在生物化學(xué)，藥物化學(xué)等領(lǐng)域中尤為突出，醫(yī)藥工業(yè)中約有30%～40%藥物是具有手性的。手性色譜是分離分析手性化合物的重要方法。毛細管電色譜

(CapillaryElectrochromatography,CEC)

毛細管電色譜毛細管電色譜(CEC)是毛細管電泳技術(shù)的高效和HPLC的選擇性的有機結(jié)合。是利用電滲流或電滲流結(jié)合壓力來推動流動相移動，物質(zhì)在CEC中根據(jù)它們在固定相與流動相中分配系數(shù)的不同和自身電泳淌度的差異得以分離。毛細管電色譜一般采用熔融的50~100μm的石英毛細管柱，柱內(nèi)填充1~3μm

的HPLC固定相，在毛細管電泳儀實現(xiàn)分離檢測。HPLC是用壓力驅(qū)動流動相，流速是隨填充微粒的大小和柱長而變化的。流體在柱管中呈拋物線輪廓（見圖），因而造成了色譜峰譜帶的展寬，降低了柱效。而CEC采用了電場推動流動相，其線速度與柱管直徑和填充微粒的大小無關(guān)，流體在毛細管中呈塞狀（見圖），因此在CEC中幾乎沒有流速梯度，譜帶展寬效應(yīng)相應(yīng)的就十分小。正是基于上述原因，CEC的分離效率明顯高于HPLC。分離類型的選擇根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質(zhì)量范圍是200～2000。對于相對分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。根據(jù)溶解度選擇弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度。如果樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳。如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇用紅外光譜法，可預(yù)先簡單地判斷樣品中存在什么官能團。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團及強氫鍵的用液一液分配色譜。

現(xiàn)列出下表作為選擇分離類型的參考。液相色譜分離類型選擇參考表

溶于水——排阻色譜，水為流動相相對分子質(zhì)量＞2000

不溶于水——排阻色譜，非水流動相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸附色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相液一液色譜相對分子質(zhì)量溶于水，不離解＜2000

排阻色譜，水為流動相堿——陽離子交換色譜溶于水，可離解酸——陰離子交換色譜溶于水，離子與非離子—反相離子對色譜HPLC分析方法建立的一般過程HPLC定性、定量分析HPLC基本實驗技術(shù)首先要查文獻資料,包括儀器廠商的應(yīng)用資料,了解他人的工作,找出你需要的參考條件。若手頭沒有合適的參考資料,則可根據(jù)分子分子量大小、在水中和有機溶劑中的溶解度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)確定分離模式,選擇主要的色譜條件：色譜柱、流動相組成和檢測器類型。評價液相色譜柱系統(tǒng)選擇的二個標(biāo)準：

①有滿意的分離度

②有合適的保留值范圍。定性分析利用保留值定性

對照保留值：在確定的色譜條件下(色譜柱、流動相組成、柱溫等),對照被測化合物與標(biāo)準樣的保留時間。標(biāo)準加入：對照樣品和加標(biāo)樣品的峰高變化確定被測化合物的色譜峰位置利用檢測器的選擇性定性（聯(lián)用技術(shù)）

采用全波長掃描吸收檢測器：對照被測化合物與標(biāo)準物的保留值和光譜圖。

采用質(zhì)譜檢測器：對照被測化合物與標(biāo)準物的保留值和質(zhì)譜圖。離線結(jié)構(gòu)分析：收集柱后流出的純組分，進行結(jié)構(gòu)分析

二.噪音N,漂移M,檢測限D(zhuǎn)是否靈敏度放大到越高越好?檢測限D(zhuǎn)(也叫敏感度)定義:為檢測器二~三倍噪聲的水平

噪音N,漂移M

D=2N/SS↑N↓D越小越敏感因此性能好的Det,不但靈敏度高而且噪聲要小組分在Det中的信號必須大于Det本底信號(噪聲)才能與噪聲區(qū)別，規(guī)定:組分信號至少為噪聲的二倍,才可定量。三.最小檢測量mminmmin定義:產(chǎn)生色譜峰高等于二倍噪聲(2N)時的進樣量

∵進樣量為m時,洗出峰高為h,記錄儀靈敏度u1m:hu1=mmin:2N∴mmin=mN/hu1=mDSc/hu1

∵Sc=u1

Fd

A/u2mA=1.065*W1/2*h(1)對濃度型Det

mmin=(1.065Fd/u2)*W1/2*D(2)對質(zhì)量型Det

mmin=(1.065*60/u2)*W1/2*D四.最小檢測濃度指一定進樣量m時,所能檢測出的最低濃度

Cmin=mmin

/

V

mg/LV--進樣體積五.線形范圍R∝C

定義:信號與進樣量成正比的數(shù)量范圍即最大允許進樣量與最小允許進樣量之比線形范圍寬:

表示不管是含量高的組分或是微量組分都能準確定量樣品制備樣品的溶解

用于溶解分析樣品的溶劑應(yīng)與液相色譜流動相互溶，最好選用流動相來溶解或提取被分析樣品的待測組分，這樣可以避免溶劑峰的干擾。

制備好的分析試液應(yīng)為均相溶液，無不溶物，否則在進行色譜分析之前應(yīng)進行0.45μm或0.2μm微孔膜過濾。目的是使樣品與所使用的HPLC方法相兼容，即把分析樣品中的待測組分轉(zhuǎn)化為適合HPLC直接進樣分析的試液。樣品前處理

a.過濾和離心：對于基體復(fù)雜的樣品液，不溶物可以通過過濾或高速離心除去。有時加入合適沉淀劑或改變?nèi)軇?，使大分子基質(zhì)以沉淀方式除去。

b.液液萃取：水樣中的待測有機化合物通過液液萃取到有機相后進行液相色譜分析

c.固相萃?。⊿olidPhaseExtraction,SPE）：利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜分離原理，使液體樣品通過一吸附劑小柱，保留其中某些組分，再選用適當(dāng)?shù)娜軇_洗雜質(zhì)，然后用少量溶劑迅速洗脫，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。

流動相的配制配制：對于二元溶劑或多元溶劑等度洗脫，液相色譜流動相通常均按溶劑體積比配制。要求溶劑必須互溶過濾：HPLC流動相使用前要用0.45m微孔膜過濾

溶于流動相的空氣會影響液相色譜系統(tǒng)的操作性能。如氣泡進入泵腔將使高壓泵流速不穩(wěn)；而流動相通過柱子時其中的氣泡受到壓力而壓縮，流出柱子到檢測器時，會因為壓力降至常壓而將氣泡釋放出來，造成檢測器噪聲增大，基線不穩(wěn)。Waters

600E型HPLC操作規(guī)程

一.沖洗流路1.開脫氣機電源,開泵控制器電源。2.按“Setup”功能鍵,設(shè)定壓力范圍。3.按“Direct”,鍵,設(shè)定流速和溶劑組成。4.開清洗閥,從多通閥抽出殘余的溶劑。5.降流速,關(guān)清洗閥,升流速,平衡色譜系統(tǒng)二.系統(tǒng)配置1.開檢測器電源。開微機電源。2.雙擊Millennium圖標(biāo),進入軟件。3.雙擊Configure

system圖標(biāo),擊Acquisition、0K。擊Acquisition

severs的“+”號,擊儀器系統(tǒng)名。4.擊File菜單,選Exit。5.雙擊Browse

Project圖標(biāo),選合適的項目名、0K。6.擊QuickSet工具。三.設(shè)置儀器方法1.擊Instrument

Method中的Edit按鈕。2.在Instruments樹下,擊600泵,輸入壓力上下限,再輸入流速和溶劑比例。3.在Instruments樹下,擊2487檢測器,設(shè)置起止波長4.選Fi1e、Save

as,輸入儀器方法名,擊Save按鈕。5.選File、Exit。

6.在QuickSet的儀器方法下的下拉菜單中選一個儀器方法7.擊Monitor,觀察基線情況。

四.運行色譜1.擊Run工具,準確抽取標(biāo)樣或樣品。2.將進樣針插入進樣孔,將進樣閥柄向上扳到Load位置3.注入溶液,再將閥柄向下扳到Iniect位置,拔出進樣針。五.色譜數(shù)據(jù)處理1.一次運行結(jié)束后,在Project的Channel中擊待處理樣品名2.擊Review工具,在3D下切取某波長的色譜。3.擊處理方法向?qū)А?.設(shè)置峰寬、臨界值、積分區(qū)間、最小峰面積(或峰高)5.輸入組分名稱和濃度。6.擊積分工具。7.選File、Save、Resuit。

六.打印色譜報告1.在Proiect中選Results標(biāo)簽,再選其中的樣品名。2.擊預(yù)覽工具,顯示Repodhblisher。3.擊Cancel按鈕,選File、New。4.選Individual、Next,再選Individual、Finish。5.選Prcject圖標(biāo),將所選的樣品拖入報告中。6.擊預(yù)覽工具,顯示待打印的報告。7.擊打印工具,再打印機上輸出報告

HPLC的環(huán)境設(shè)置：

HPLC的日常操作條件：溫度：10-30℃；相對濕度<80％；最好是恒溫、恒濕，遠離高電磁干擾、高振動設(shè)備，有良好的通風(fēng)設(shè)施。HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：1專門的純水機或超純水機；2去離子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用類似家用的純水機；5市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水；6其它途徑；不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)越高放置時間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。HPLC六通閥進樣器的保養(yǎng)進樣樣品要求無微粒和能阻死針頭及進樣閥的物質(zhì)，樣品溶液均要用0.45μm的濾膜過濾。防止微粒阻塞進樣閥和減少對進樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進樣閥的Load和Inj