流式細(xì)胞術(shù)的原理和臨床

關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)的原理和臨床第1頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

概

述流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM）是一種自動分析細(xì)胞的高技術(shù)，其原理是懸浮在液體中的分散細(xì)胞一個個地依次通過測量區(qū)，當(dāng)每一個細(xì)胞通過測量區(qū)時產(chǎn)生電信號，這些信號可以代表熒光、光散射，光吸收或細(xì)胞的阻抗等。這些信號可以被測量、存貯、顯示，于是細(xì)胞的一系列重要的物理特性和生化特性就被快速地、大量地測定。第2頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五上述特性可以是細(xì)胞的大小、活性，核酸的數(shù)量、酶、抗原等等。儀器還可以根據(jù)所規(guī)定的參量把指定的細(xì)胞亞群從整個細(xì)胞群體中分選出來。流式細(xì)胞術(shù)在當(dāng)前的細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、遺傳學(xué)、病理學(xué)、臨床檢驗(yàn)學(xué)等各領(lǐng)域有著十分廣泛的用途。

第3頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五流式細(xì)胞術(shù)是對懸液中的細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行快速可達(dá)每秒鐘數(shù)千個乃至上萬個細(xì)胞。這樣，它就可與顯微鏡相互補(bǔ)充。顯微鏡術(shù)可以研究組織的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位和熒光在細(xì)胞中的分布；而多數(shù)流式細(xì)胞術(shù)是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個細(xì)胞的總核酸，總蛋白等而不能測量細(xì)胞中某一特定部位的核酸或蛋白，這是它的不足之處。第4頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

由于現(xiàn)代熒光技術(shù)和多參數(shù)相關(guān)測量技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞群體或組成群體的亞群進(jìn)行定量分析時，又具有其他手段無法比擬的優(yōu)越性。用飛點(diǎn)掃描技術(shù)或縫隙掃描技術(shù)得到了細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面低分辨率的信息，從而改變了流式細(xì)胞儀零分辨率的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。第5頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)FCM是由細(xì)胞流動室、光源、聚光裝置、信號檢測器、電子計算機(jī)及高級別儀器具有的細(xì)胞分選裝置構(gòu)成。第6頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五細(xì)胞流動室細(xì)胞流動室是FCM的心臟，它是根據(jù)流體力學(xué)中的層流鞘液原理設(shè)計而成，其結(jié)構(gòu)包括石英小室形成的鞘液腔及插入其中的樣品管。細(xì)胞呈單個排列通過流動室。第7頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五光源常用激光器：氫離子激光器488nm蘭色激光氬離子激光器氪離子激光器第8頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五聚光系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)透鏡、小孔、多種濾片檢測器、放大器將光信號變成電脈沖信號第9頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五計算機(jī)信號變成數(shù)據(jù)文件存儲、分析。第10頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

流式細(xì)胞儀的工作原理

待測細(xì)胞被制備成單個細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入流動室。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細(xì)胞液柱。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點(diǎn)稱為測量區(qū)。第11頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五流式細(xì)胞儀的工作原理通過測量區(qū)的細(xì)胞被激發(fā)產(chǎn)生熒光。在與入射光束和液柱垂直的方向放置光學(xué)系統(tǒng)（透鏡、光闌、濾片和檢測器等）用以收集熒光信號。圖中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光，二色性反射鏡用于選擇被測熒光波長，熒光檢測器是光電倍增管（PMT），散射光檢測器是光電二極管，用來收集前向角散射光（FSC）。第12頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五細(xì)胞分選（cellsorting）的工作原理液滴形成信號的頻率約30KHz，此信號加在壓電晶體上使之產(chǎn)生同頻的機(jī)械振動，流動室也就隨之振動。于是液柱斷裂成一連串均勻的液滴，其形成的速度為每秒3萬個。細(xì)胞通過噴嘴的速度大約每秒2000個以下，如以2000個計算則平均每15個液滴中有一個液滴包有細(xì)胞，而其他液滴無細(xì)胞。細(xì)胞的性質(zhì)是在進(jìn)入液滴以前已經(jīng)被測定了的。第13頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五細(xì)胞分選（cellsorting）的工作原理如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特性相符，則儀器在這個被選定的細(xì)胞剛形成液滴時給整個液柱充以指定的電荷。這樣，當(dāng)被選定的細(xì)胞形成液滴時就帶有特定的電荷，未被選定的細(xì)胞形成的細(xì)胞液滴及不包含細(xì)胞的空白液滴不被充電，也不帶電荷。帶有電荷的液滴向下落入指定的收集器內(nèi)，從而完成了細(xì)胞分類收集的目的。第14頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五流式細(xì)胞儀的分選原理第15頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五流式細(xì)胞儀原理示意圖第16頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

散射光的測量

在流式細(xì)胞術(shù)中，從光的散射信號可以得到非常有價值的信息。因?yàn)榧?xì)胞對光的散射是細(xì)胞在未遭受任何破壞情況下固有的特性，所以可以用散射光的信號對未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。第17頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五細(xì)胞在液流中通過測量區(qū)時，經(jīng)激光照射，細(xì)胞向空間360°立體角的所有方向散射光線，散射的信號與細(xì)胞的大小、形狀，質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。經(jīng)過固定和染色的細(xì)胞，因折射率有了變化，故其散射狀況與未固定或未染色的不同。第18頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

散射光與細(xì)胞參量間的關(guān)系與散射角、照射光束的形狀、收集散射光立體角的大小等都有關(guān)。在流式細(xì)胞術(shù)中常被利用的有前向角散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC），前者亦稱0°散射，后者亦稱90°散射。

第19頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五熒光測量

熒光信號是由對細(xì)胞進(jìn)行染色的特異性熒光染料受激后發(fā)射的。熒光波長與激發(fā)光波長不同且強(qiáng)度較弱，為此就要使用濾片以濾除非熒光信號并使用靈敏的探測器。下面我們將分別進(jìn)行討論。第20頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五熒光測量激光與普通光線不同；激光是受激輻射，普通光線是自發(fā)輻射。激光基本是沿著直線傳播，發(fā)散角很小，通常在10-6球面度量級的立體角內(nèi)，必要時很容易聚焦到與細(xì)胞同一數(shù)量級。激光的亮度高，即在單位面積、單位立體角內(nèi)輸出功率特別大。激光還具有良好的單色性，這些特點(diǎn)都是貢燈所不具備的。

第21頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五熒光測量流式細(xì)胞術(shù)中使用的多為氬離子激光器，亦有用氪離子激光器或染料激光器以獲得不同的譜線者。氬離子激光器是一種氣體激光器，其頻率穩(wěn)定性高、相干性好、壽命長。第22頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五熒光測量氬離子激光器是通過氣體放電使氬離子電離并激發(fā)，實(shí)現(xiàn)粒子數(shù)反轉(zhuǎn)而產(chǎn)生激光，譜線共十余條，其中綠光514nm和藍(lán)光488nm兩條譜線最強(qiáng)，幾乎占總輸出功率的80%。由于這種激光在氣體放電過程中要使氬離子一次電離必須供給相當(dāng)大的能量，所以要求有幾百伏和每平方毫米幾個安培的穩(wěn)定電源。第23頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

檢測器——光電倍增管和硅光電二極管對從紫外到可見光的探測，有二類光電器件可供選擇：一類是真空光電器件；另一類是半導(dǎo)體器件。后者在某些方面有一定優(yōu)點(diǎn)，如在強(qiáng)光照射時過載特性較好，但在某些方面則明顯地不及真空光電器件。下面對光電倍增管和硅光電二極管作一簡單的比較。

第24頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五在200—900nm譜區(qū)光電倍增管有很好的響應(yīng)，量子效率高，而硅光電管則相當(dāng)差。光電倍增的時間響應(yīng)比半導(dǎo)體器件快得多，特殊的光電倍增管上升時間可僅為ns數(shù)量級，而硅光電管在考慮到分布電容和負(fù)載時，實(shí)際上升時間可能達(dá)數(shù)10US。

第25頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五至于探測器的靈敏閾即探測極限，則與信噪比有關(guān)。假定信噪比等于1，用光電倍增管在探測波長為400nm的譜線時，能測得的最小信號功率約為2×10-17w，而硅光電管在波長1060nm處能探測到的最小功率大于2×10-13W，兩者相差四個數(shù)量級。

第26頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五光電倍增管的增益可從103到108連續(xù)可調(diào)，而一般硅光電管沒有增益。在光線較弱時光電倍增管有很好的穩(wěn)定性，但是當(dāng)光線很強(qiáng)時硅光電管就比光電倍增管穩(wěn)定多了，所以在探測FSC時用硅光電管是合適的。由于熒光比SSC較FSC弱得多，這時探測器靈敏度是主要問題，因而應(yīng)采用光電倍增管。

第27頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五自發(fā)熒光

未染色的細(xì)胞受到光照射后所發(fā)出的熒光稱自發(fā)熒光。用流式細(xì)胞計測定細(xì)胞的特異性熒光染料的熒光時，這種自發(fā)熒光對所欲測定的特異性熒光是一種本底信號，自發(fā)熒光在多種情況下都會干擾特異性熒光信號，尤其是對低水平結(jié)合的熒光抗體它能減低染色的和未染色的細(xì)胞間的區(qū)別，使我們難以確定細(xì)胞中熒光信號的水平。

第28頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五自發(fā)熒光的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、細(xì)胞的類型、激發(fā)光的波長、發(fā)射光的檢測范圍等都有關(guān)系。產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子可能是正常細(xì)胞的組成成分如核黃素、細(xì)胞色素等。這些成分在較大的細(xì)胞中含量較多，相應(yīng)的自發(fā)熒光也就強(qiáng)一些。

第29頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五培養(yǎng)的細(xì)胞中死細(xì)胞比活細(xì)胞的自發(fā)熒光要強(qiáng)，在某些細(xì)胞樣品如脾和骨髓中，除了含有淋巴細(xì)胞和其他低自發(fā)熒光的細(xì)胞外還可能會有一些占不同比例的亮細(xì)胞，它們會干擾用免疫熒光方法本應(yīng)能檢測出來的稀有的、細(xì)胞數(shù)目較少的亞群。

第30頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五為減少自發(fā)熒光，應(yīng)選用較亮的熒光染料，還應(yīng)使用與熒光發(fā)射光譜相匹配的光學(xué)品質(zhì)優(yōu)良的濾片系統(tǒng)。利用較長波長的光線，如染料激光器的激光做為激發(fā)光源，也可減弱自發(fā)熒光。最后，對自發(fā)熒光還可用電子線路補(bǔ)償?shù)姆椒▽⒆园l(fā)熒光補(bǔ)償?shù)?。?1頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

細(xì)胞群體的DNA直方圖流式細(xì)胞計測量的結(jié)果可為一數(shù)字矩陣，此矩陣可用一個或數(shù)個圖形來表示。下面我們討論一下，一個細(xì)胞群體的DNA直方圖的圖形。

第32頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五設(shè)一個指數(shù)生長的細(xì)胞群體全部細(xì)胞都處于增殖狀態(tài)，用細(xì)胞動力學(xué)的語言說，就是增殖比是1。細(xì)胞群體經(jīng)染色后,由于每個細(xì)胞結(jié)合的染料與DNA含量成正比。由于G1期細(xì)胞的DNA含量為2C，G2和M期細(xì)胞DNA含量為4C，S期細(xì)胞的DNA含量在2C—4C之間。第33頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五于是，從理論上說，這樣一個群體的DNA直方圖應(yīng)該是：即G1期細(xì)胞全體都在同一熒光道上63道，G2和M期細(xì)胞則位于2*63=126道處，S期細(xì)胞位于63—126道之間，由于DNA合成速率不是均一的，因而在這一段范圍內(nèi)不會是均勻分布。第34頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五第35頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五細(xì)胞周期和DNA分布直方圖

A細(xì)胞周期BDNA直方圖的理論分布C實(shí)際的DNA直方圖第36頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五第37頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

流式細(xì)胞儀的技術(shù)指標(biāo)

1.熒光分辨率

是表明儀器測量所能達(dá)到的最大精度，通常用變異系數(shù)表示。顯然它與被其測定的標(biāo)準(zhǔn)樣品有關(guān)。2.熒光靈敏度

以能檢測到最少的FITC分子來表示，即微球上最少標(biāo)有多少個FITC分子時剛好能被檢測到，即定義為熒光靈敏度。

第38頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五3．前向角散射光靈敏度

以前向角散射光最小能檢測到的顆粒直徑表示。一般儀器能檢測到的最小的直徑在0.3um左右。4．前向角散射光分辨率

以變異系數(shù)表示。一般約在2.0%。第39頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五

5．分析/分選速度

分析速度可達(dá)每秒5000-10000個細(xì)胞，分選速度為每秒5000個細(xì)胞通過測量區(qū)。6.分選純度

分選純度是個比較復(fù)雜的問題，它不但與儀器精度有關(guān)，而且與被分選的細(xì)胞亞群在整個群體中的相對位置也有關(guān)系。如果被分選的亞群在直方圖或二維點(diǎn)圖上可清晰地分辨出來且與其他亞群無重疊，則分選結(jié)果的純度就高，反之就低。

第40頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五7.分選收獲率

定義為通過測量區(qū)應(yīng)被分選的細(xì)胞如果有100個，實(shí)際落到指定收集器中的數(shù)目為95個，此稱為收獲率95%。一般應(yīng)在90%以上。收獲率與分選純度是呈負(fù)相關(guān)。除以上7個參數(shù)外，還有樣品濃度，同時可測參數(shù)、光源、噴孔尺寸、計算機(jī)配置等參數(shù)或指標(biāo)。第41頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五細(xì)胞的參量和熒光探針

流式細(xì)胞術(shù)能夠測量細(xì)胞的很多參量?？煞譃閮深悾阂活愂莾?nèi)部參量，指不用任何熒光探針標(biāo)記就可測量的細(xì)胞參量；另一類是外部參量，指需要外加熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞參量。同時又可將細(xì)胞參量分為結(jié)構(gòu)參量和功能參量，結(jié)構(gòu)參量描述細(xì)胞的形態(tài)特征和化學(xué)組成，功能參量描述細(xì)胞的理化特征。這被稱為細(xì)胞參量的二維分類。第42頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五測量細(xì)胞的外部參量必須用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記。熒光探針（熒光染料）是探測細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非常靈敏的工具。

第43頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五常用的熒光素FITC異硫氰酸基熒光素488PE藻紅蛋白545PI碘化丙啶490EB溴化乙啶480AO丫啶橙490TRITC四甲基若丹明554TexasRed德州紅355第44頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五參數(shù)

結(jié)構(gòu)

功能

內(nèi)部

細(xì)胞大小、形狀，細(xì)胞質(zhì)的顆粒

氧化還原狀態(tài)

性，色素量，蛋白熒光

外部

DNA量、堿基比例，染色體結(jié)構(gòu)膜的完整性，通透性，

酶RNA量，總蛋白，堿性蛋白

活性，內(nèi)吞性，表面電荷，

表面糖類。

細(xì)胞內(nèi)受體，DNA合成，

膜的流動性或微粘度，細(xì)

胞質(zhì)/線粒體膜

電位，膜結(jié)合

的鈣離子，細(xì)胞內(nèi)PH第45頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五數(shù)據(jù)分析一、數(shù)據(jù)的顯示通常可分一維單參數(shù)直方圖、二維點(diǎn)圖二維等高圖和假三維圖等幾種，以下分別講述。第46頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期五二維點(diǎn)陣圖第47頁，共58頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)56分，星期