遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段超級(jí)簡(jiǎn)化版課件

遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段進(jìn)展北大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心戚豫研究員2022/11/11遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段進(jìn)展北大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心2022/10/22007,Illumina推出Solexa;ABI推出SOLid…均能在3天內(nèi)完成1人的全基因組測(cè)序2022/11/122007,Illumina推出Solexa;ABI推出SO2022/11/1遺傳病和基因的數(shù)量？遺傳病總數(shù)：14,861種(Online-MendelianInheritanceinMan,OMIM,by2015-3-21)人類基因總數(shù)：≥24,000個(gè)人類各種結(jié)構(gòu)和功能蛋白：100,000種89種表型和基因全清楚；4,381種表現(xiàn)找到致病突變——意味著可做直接的基因診斷的病種很少！已知序列：10,391個(gè)基因——可做間接診斷的很多！32022/10/23遺傳病和基因的數(shù)量？遺傳病總數(shù)：14,8“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因?yàn)橐磺腥梭w正常生理功能和病理狀態(tài)都是由基因決定的狹義：因基因突變而引發(fā)的疾病如何區(qū)分三個(gè)概念：

遺傳性疾?。号c環(huán)境因素引起的疾病對(duì)立

先天性疾?。嚎梢允菄a(chǎn)期感染/藥物所致

家族性疾?。嚎赡茈S著成員的遷出而終止2022/11/14“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因?yàn)橐磺腥梭w正常生理功能和病發(fā)病頻率——總計(jì)占我國(guó)出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每一項(xiàng)只占萬(wàn)分之幾到千分之幾按系統(tǒng)分類排名前5位：神經(jīng)系統(tǒng)：智力低下、代謝障礙、癲癇心血管系統(tǒng)：先心病內(nèi)分泌系統(tǒng)：糖尿病、腎上腺皮質(zhì)增生生殖系統(tǒng)：不孕不育骨骼系統(tǒng)：多指/趾-并指/趾、軟骨發(fā)育不良2022/11/15發(fā)病頻率——總計(jì)占我國(guó)出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每2022/11/1先天性疾病的誘發(fā)因素遺傳原因后天環(huán)境所致，因素：物理：X-ray、微波、超聲波、熱化學(xué)：砷、鉛、汞（水俁?。┑葻o(wú)機(jī)物；橙劑、EB（溴乙啶）等有機(jī)物生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等圍產(chǎn)期因素誘變，但不肯定致病圍產(chǎn)期因素只侵犯到個(gè)別器官，但注意與嵌合遺傳（mosaic）區(qū)分62022/10/23先天性疾病的誘發(fā)因素遺傳原因62022/11/1如何檢出？高危人群環(huán)境暴露既往病史家族史感染史遷居情況……遺傳DNA/RNA

環(huán)境無(wú)論外來(lái)病原體還是本身異常，遺傳物質(zhì)的檢測(cè)都是有效手段72022/10/23如何檢出？高危人群遺傳2022/11/1實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段,分辨率,

和范圍染色體核型Karyotyping:109bp,2800倍鏡下可見(jiàn)熒光原位雜交FISH:107bp,一個(gè)基因的一部分多重探針連接擴(kuò)增MLPA:105bp,幾十個(gè)基因比較基因組雜交CGHArray:105bp,幾個(gè)基因間接基因診斷:103~105bp,一個(gè)或數(shù)個(gè)基因直接基因診斷PCR-Sequencing:1bp,一個(gè)基因Affymatricchip:1bp,數(shù)千個(gè)基因,半個(gè)基因組Genome-Wide-Sequencing:1bp,全部2.4萬(wàn)個(gè)基因注：bp,basepair,堿基對(duì)82022/10/23實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段,分辨率,和范圍染色體2022/11/1從核型;FISH;arrayCGH;MLPA;

到CMA(chromosomalmicroarrayanalysis,染色體微陣列,分子核型)——細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)相結(jié)合的方法臨床細(xì)胞遺傳學(xué)的歷史是伴隨著一系列識(shí)別染色體方法的技術(shù)進(jìn)步發(fā)展臨床細(xì)胞遺傳學(xué)基本工作：核型分析國(guó)內(nèi)主要中期染色體核型，G顯帶在400條國(guó)外高分辨染色體核型，G顯帶在1500條條件：細(xì)胞培養(yǎng)，光鏡，核型分析系統(tǒng)軟件92022/10/23從核型;FISH;arrayCGH2022/11/11、染色體核型Karyotyping

——基于顯微鏡下濃聚的染色體形態(tài)檢查方法：

G帶、R帶、Q帶（550條，7組）高分辨染色體分帶（>1500條）

FISH（熒光原位雜交）：分裂間期染色體畸變種類：數(shù)目異常（整倍和非整倍）結(jié)構(gòu)異常:-;+;t;del;ins;inv;dup;invdup;fra(X)(q27.3):脆性X;der:衍生染色體;r(13):13號(hào)染色體呈環(huán)狀（暗示有缺失）;i(Xq):等臂Xq102022/10/231、染色體核型Karyotyping

2022/11/12、熒光原位雜交技術(shù)FISH(fluorescenceinsituhybridization,)可以結(jié)合，但不依賴于核型分析單色與多色FISH，如SKY-FISH(光譜式多色染色體)是鑒別基因組發(fā)生較大缺失或重復(fù)金標(biāo)準(zhǔn)不足：一次雜交識(shí)別的范圍有限——需要很好的臨床診斷或其他提示，花費(fèi)大人力多，設(shè)備高級(jí)方法：探針標(biāo)記，細(xì)胞或染色體的原位雜交條件：探針(cosmid)、DNA提取、PCR、真空干燥、圖像采集與分析112022/10/232、熒光原位雜交技術(shù)FISH(fluo2022/11/1FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析系統(tǒng)122022/10/23FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析2022/11/13、多重探針連接擴(kuò)增MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)

SchoutenJP第一次描述一種基于PCR反應(yīng)，通過(guò)毛細(xì)管電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物是一種高分辨的，用于檢測(cè)基因組序列拷貝數(shù)變異的方法(NucleicAcidsRes.2002Jun15;30(12):e57)

132022/10/233、多重探針連接擴(kuò)增MLPA(mu2022/11/1

同時(shí)檢測(cè)40個(gè)基因組序列異常，幾乎每個(gè)染色體2個(gè)近端粒常有微缺失涉及不育、發(fā)育、智力，可一次查全僅需要20ng的DNA

能檢測(cè)單個(gè)外顯子exon的拷貝數(shù),

探針辨認(rèn)短的基因組序列,部分變性的DNA,如石蠟包埋,甲醛固定的樣本均可使用相對(duì)定量40個(gè)mRNA,鑒定啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài),檢測(cè)已知的突變和SNPS

MLPA方法功能、特點(diǎn)

142022/10/23同時(shí)檢測(cè)40個(gè)基因組序列異常，幾乎每個(gè)2022/11/1MLPA反應(yīng)過(guò)程152022/10/23M152022/11/1MLPA結(jié)果判定相對(duì)峰域與對(duì)照相比減少35-50%判定缺失相對(duì)峰域與對(duì)照相比增加35-50%判定重復(fù)突變/多態(tài)性位于探針的連接點(diǎn)或與探針的連接點(diǎn)很近也可能導(dǎo)致相對(duì)峰域減少單一的外顯子缺失需要其他方法證實(shí)結(jié)果分析2例162022/10/23MLPA結(jié)果判定相對(duì)峰域與對(duì)照相比減少32022/11/1172022/10/23172022/11/1182022/10/23182022/11/1MLPA

需要條件PCR儀測(cè)序儀192022/10/23MLPA

需要條件PCR儀192022/11/14、比較基因組雜交

(Comparativegenomichybridization,CGH)什么是CGH:1992年Kallioniemi創(chuàng)立的基于熒光標(biāo)記和分子、細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)鑒定基因組DNA的獲得、丟失和擴(kuò)增，并且可以把這些遺傳變異定位在正常的中期染色體上的一種技術(shù)特點(diǎn):在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用一張中期染色體涂片分析全基因組的大的DNA序列拷貝數(shù)的不平衡改變(獲得和丟失)，即因劑量的變化而不需要分裂的細(xì)胞缺點(diǎn):與測(cè)序相比分辨率不高，擴(kuò)增子約2Mb，檢出的缺失大小5～10Mb——但也是個(gè)優(yōu)點(diǎn)：容易辨識(shí)和解釋

1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH目前最通用的是美國(guó)安捷倫公司(Agilent)的平臺(tái)，已成為國(guó)際上遺傳病診斷、流產(chǎn)組織分析和種植前診斷PGD的第一線手段(first-line)202022/10/234、比較基因組雜交(Comparati2022/11/1MicroarrayBACs/PACsDNA探針固定在玻璃片上ArrayedbyroboticallyprintingDNAontoslidesAgilentscannerOldarray-CGH212022/10/23MicroarrayOldarray-2022/11/1Patient2ThispatientpresentedtotheLaboratoryat12monthsofagewithinfantilespasmsanddevelopmentaldelay.Hisheadcircumferencewasbelowthe2ndcentileandweightwasbetweenthe10to25thcentile.Seizurescontinueddaily.Atareviewat32monthsbrachycephaly,lowanteriorhairline,hypertelorism,andalargeprotrudingtongueweresomeoftheadditionalfeaturesobserved.SubtelomericFISHrevealedadeletionofthedistal9qprobePAC112N13.Array-CGHshowedthepatienthasa1.5-1.8Mbdeletionofdistal9q.FurtherFISHevaluationestablishedthedeletionas1.7MbwithbreakpointsbetweentheBACclonesRP11-83N9andRP11-695L17.222022/10/23Patient2222022/11/111qduplication

10qdeletionPatient5Malepatientwhopresentedat18yearsofagewithintellectualdisability,autismanddysmorphicfeatures.SubtelomereFISHshowedaunbalancedtranslocation,withanadditionalcopyofthe11qprobePAC770G7presentondistal10q.Thedistal10qprobePAC137E24Gwasnotpresent.232022/10/2311qduplication10q2022/11/1Newarray-CGH?用不同的顏色熒光標(biāo)記等量病人的測(cè)試和參照DNA加入HumanCot1DNA在Microarray上進(jìn)行雜交

雜交后洗去未結(jié)合的和錯(cuò)配的靶DNA高分辨掃描儀芯片242022/10/23Newarray-CGH?用不同的顏色2022/11/1雙色激光掃描紅色CY5綠色CY3F值產(chǎn)生

referenceDNApatient=252022/10/23雙色激光掃描reference=25真實(shí)掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/11/126真實(shí)掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/10Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列出部分）2022/11/127Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列2022/11/1什么是基因診斷？狹義：針對(duì)致病基因的突變分析——是一種直接的診斷擴(kuò)展：利用致病基因的多態(tài)性(polymorphism)；或利用相鄰的多態(tài)性標(biāo)記(polymorphicmarkers)進(jìn)行連鎖分析——是一種間接的診斷廣義：通過(guò)對(duì)疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，包括復(fù)制(DNA)、表達(dá)(RNA)和翻譯(蛋白質(zhì))加以全過(guò)程分析所做出的診斷282022/10/23什么是基因診斷？狹義：針對(duì)致病基因的突變2022/11/1基因診斷技術(shù)基礎(chǔ):PCR聚合酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreaction,PCR):1985年發(fā)明,1992諾貝爾獎(jiǎng)試管在熱循環(huán)儀(PCR儀)中反應(yīng)幾小時(shí)，待測(cè)基因片段，專一地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍PCR過(guò)程：加熱變性：分開(kāi)模DNA雙鏈冷卻復(fù)性：使引物與目標(biāo)序列特異結(jié)合保溫延長(zhǎng)：使引物按模板序列延長(zhǎng)292022/10/23基因診斷技術(shù)基礎(chǔ):PCR聚合酶鏈反應(yīng)(2022/11/1PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR反應(yīng)場(chǎng)所以及302022/10/23PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR反應(yīng)場(chǎng)所2022/11/1不適合做PCR診斷的病種染色體病大片段基因缺失和重排所致的遺傳?。?/p>

解決辦法：細(xì)胞遺傳學(xué)，熒光原位雜交FISH、多重探針連接擴(kuò)增MLPA、比較基因組雜交CGH、基因芯片Affymatricarray和大規(guī)模全基因組測(cè)序……基因巨大(Megabases)且無(wú)熱點(diǎn)突變的遺傳?。篘F1、DMD、BMD、ADPKDetc.

解決辦法：雜交、酶學(xué)、代謝產(chǎn)物、功能分析，截短蛋白分析法(ProteinTruncationTest,PTT)、色譜、串聯(lián)質(zhì)譜……312022/10/23不適合做PCR診斷的病種染色體病312022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需要查閱OMIM遺傳病數(shù)據(jù)庫(kù)()322022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需2022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診斷適用范圍和必要性有器官組織差異性而不適合做組織活檢的遺傳?。簂ongQT等心臟病、糖原累積癥I型(vonGierke型)、癲癇等腦病……診斷后可以治療或提前預(yù)防發(fā)病的遺傳?。喝鏟KU、肝豆?fàn)詈俗冃院虶6PD缺乏癥……可以進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的嚴(yán)重的先天代謝病，嚴(yán)重的精神疾患或惡性早期致死性疾病：如性別畸形和性發(fā)育異常而找不到染色體異常?？赏ㄟ^(guò)選擇性流產(chǎn)加以預(yù)防傳統(tǒng)方法不能診斷、診斷不確切的家族性疾?。憾嘁猿ｏ@、X連鎖和母系方式遺傳?？勺鲞B鎖分析332022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診2022/11/1例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對(duì)氨基甙類如卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素以及鏈霉素等超級(jí)敏感條件致病——使用氨基甙類藥物母系遺傳——線粒體DNA上編碼12SrRNA的基因存在致病突變A1555G一旦發(fā)現(xiàn)，可對(duì)全家進(jìn)行該突變的篩查發(fā)布用藥禁忌342022/10/23例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對(duì)氨基甙類如2022/11/1Ⅲ-1(先證者)Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-4

A>G:＋

＋

－

＋

－＋

＋

＋

＋＋線粒體mtDNA1555A>G基因診斷(＋：有突變)II-1Ⅱ-2Ⅱ-3Ⅱ-4氨基甙類耳毒家系的基因診斷示意圖I-1I-2352022/10/23Ⅲ-1(先證者2022/11/1例2線粒體病的基因診斷mitochondrion線粒體是細(xì)胞的能量工廠…362022/10/23例2線粒體病的基因診斷mitochon2022/11/1Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴(yán)重性：在我院兒科臨床診斷的35例中，死亡29例（83%）。目前生存僅僅6例。Leigh病是一種線粒體病，但僅僅有20%由mtDNA突變突變所致，80%由核基因突變所導(dǎo)致。基因檢查：mtDNA突變檢出率極低——229臨床診斷病例中僅僅檢出3例：T8993C2例和T8993G1例（死后尸解結(jié)果mtDNAMut%：血=85%;肌肉=94%;腦=98%；其母外周血=10%）372022/10/23Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴(yán)重2022/11/1病例1、臨床表現(xiàn)男，4月，主因精神發(fā)育倒退、驚厥入院第一胎，孕9月疑潛在性缺氧行剖宮產(chǎn)，生后無(wú)窒息；2月內(nèi)發(fā)育如常，后出現(xiàn)倒退，表現(xiàn)為頸部發(fā)軟、四肢活動(dòng)差、吸吮能力減弱、低熱、陣發(fā)性呼吸暫停（2~8次/日）檢查：間斷抽搐，四肢肌力、肌張力低下，病理征(-)。血乳酸高、代謝性酸中毒。EEG示左側(cè)為主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。MRI示缺血改變：雙側(cè)殼核、丘腦區(qū)異常信號(hào)；腦白質(zhì)發(fā)育落后。兩次眼底檢查未見(jiàn)異常呼吸節(jié)律不整，死前突然出現(xiàn)嘆氣樣呼吸…父31歲、母30歲，均無(wú)遺傳病家族史382022/10/23病例1、臨床表現(xiàn)男，4月，主因精神發(fā)育倒2022/11/1392022/10/23392022/11/1402022/10/23402022/11/1方法PCR擴(kuò)增mtDNA8791-9413片段(622bp)分別用限制性內(nèi)切酶MspI和SmaI酶解PCR產(chǎn)物2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶解片段對(duì)EB染色的片段進(jìn)行密度掃描，突變比例（Mut%）=突變新增片段密度/原有片段殘留密度+突變新增片段密度結(jié)果患兒體內(nèi)存在高比例的8993T>G突變患兒1親屬中母親含較低比例的同樣突變患兒1肌和腦組織病理檢查符合嬰兒型Leigh綜合征診斷患兒1MRI示腦缺氧性改變M

患兒肌肉患兒血母親陰性對(duì)412022/10/23方法結(jié)果M患兒肌肉患兒血母親2022/11/1患者L1以第1對(duì)引物擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果T8993GT8993C患者L2以第1對(duì)引物擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果422022/10/23患者L1以第1對(duì)引物擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物直接2022/11/1患者CT和死后尸解432022/10/23患者CT和432022/11/1病理改變：灰質(zhì)為主的海綿樣改變，神經(jīng)細(xì)胞壞死和毛細(xì)血管增生。陳舊病變出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，新鮮病變存在格子細(xì)胞。腦干黑質(zhì)、舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核和前庭神經(jīng)核在不同病人均受累。其他部位病變可以僅限于腦干，也可以同時(shí)累及脊髓灰質(zhì)、基底節(jié)、大腦和小腦皮層以及白質(zhì)。442022/10/23病理改變：灰質(zhì)為主的海綿樣改變，神經(jīng)細(xì)胞2022/11/1“間接法”基因診斷——連鎖分析

例：苯酮尿癥(PKU)的診斷致病基因：苯丙氨酸羥化酶PAH方法：細(xì)菌抑制實(shí)驗(yàn)(篩查)

苯丙酮酸和PAH定量基因診斷困難

70多種突變基因大，突變很分散檢測(cè)突變成本高，周期長(zhǎng)直接檢測(cè)突變或連鎖分析?452022/10/23“間接法”基因診斷——連鎖分析

2022/11/1連鎖分析方法產(chǎn)前診斷PKU

——選擇幾對(duì)染色體標(biāo)記(marker)

←A

←B

連鎖分析示意圖需要多態(tài)性標(biāo)記（與PAH基因在染色體上的距離越近越好）對(duì)先證者(BB)及家系成員(父-AB;母-BC;胎兒-AC)的標(biāo)記進(jìn)行分型(genotyping)胎兒-AC：不受累！連鎖診斷準(zhǔn)確度：marker與致病基因的連鎖程度——有1%的交換率，理論可信度為99%←C

462022/10/23連鎖分析方法產(chǎn)前診斷PKU

——選擇幾對(duì)2022/11/1產(chǎn)前基因診斷對(duì)象：胎兒的DNA、代謝產(chǎn)物或酶蛋白取材：絨毛(8周)、羊水(16周)、胎兒靜脈血手段：針對(duì)代謝產(chǎn)物：HPLC、GC-MS(有組織特異性)

酶活性：特異性人工底物顯色(有組織特異性)

針對(duì)基因：RFLP、PCR等(無(wú)組織特異性)要求：雙取樣、雙方法、有資質(zhì)、有質(zhì)控準(zhǔn)入：目前北京7家，專家委員會(huì)審核和年審管理:《北京市產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前篩查工作規(guī)范》《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》472022/10/23產(chǎn)前基因診斷對(duì)象：胎兒的DNA、代謝產(chǎn)物體細(xì)胞嵌合的遺傳病（生殖細(xì)胞嵌合異常比例過(guò)低也不行）組織器官異質(zhì)性過(guò)大（線粒體?。﹪?guó)家法律和行業(yè)規(guī)定不允許的范圍，如“天才基因”兒的選擇（遺傳不平衡）性別鑒定（除非性連鎖疾?。┏蕯?shù)量遺傳的多基因病或遺傳相關(guān)的復(fù)雜遺傳病以及沒(méi)有做好準(zhǔn)備的家庭……2022/11/1哪些病不適合產(chǎn)前基因診斷48體細(xì)胞嵌合的遺傳病（生殖細(xì)胞嵌合異常比例過(guò)低也不行）2022

非侵入性產(chǎn)前檢查NIPT——血漿游離DNA突變檢測(cè)技術(shù)

TTTTCTTTTCc.2383C>Tc.2383C>Tc.4005delGc.4005delGG2671**2022/11/149非侵入性產(chǎn)前檢查NIPTTTTTCTTTTCc.2383母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetalcf-DNAdetectedviaYchromosome,Lancet1997胎兒游離DNA：cell-freefetalDNA(cffDNA)母體外周血含有cffDNA，幾乎全部來(lái)源于胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞。懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。（7周建立胎兒胎盤(pán)循環(huán)）。cffDNA片段比較小，長(zhǎng)度在75bp和250bp之間。母體外周血中的cffDNA含量在5%到30%之間。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。與母親體重有關(guān)。產(chǎn)后2hr之內(nèi)消失。2022/11/150母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetal22條常染色體23條常染色體20%胚胎

DNA380%2胎兒80%母親染色體非整倍體導(dǎo)致劑量變化2022/11/15122條常染色體23條常染色體20%胚胎DNA380%2胎技術(shù)和科學(xué)的目標(biāo)

thatgovernmentofthepeople,bythepeople,forthepeople,shallnotperishfromtheearth.————byAbrahamLincoln2022/11/152技術(shù)和科學(xué)的目標(biāo)thatgovernmentofth基因診斷的制高點(diǎn)——多基因?。?/p>

能否靠基因芯片或微陣列解決？Randomarrayofclusters100um2022/11/153基因診斷的制高點(diǎn)——多基因?。?/p>

能否靠基因芯片或微2022/11/1劃時(shí)代的新技術(shù)——大規(guī)模二代測(cè)序NGS(NextGenerationSequencing)

人類基因組計(jì)劃長(zhǎng)達(dá)10年、耗資千億、6國(guó)數(shù)萬(wàn)科學(xué)家投入，僅完成4個(gè)人的基因

2007年：1人，3天內(nèi)，3000美元，費(fèi)用和時(shí)間在以每年遞減一半的速度下降——取代所有一切，40種常見(jiàn)病發(fā)表。。。多基因病時(shí)代來(lái)了？SOLEXA_illumina1GGenomeAnalyzer542022/10/23劃時(shí)代的新技術(shù)——大規(guī)模二代測(cè)序NGS(2022/11/1InstrumentwithoutCoversFluidics&electronicsFlowcell&detectionLaseroptics552022/10/23InstrumentwithoutC2022/11/1FlowcellinImagingLocation562022/10/23FlowcellinImaging2022/11/1基因診斷和產(chǎn)前基因診斷中的知情同意和倫理學(xué)問(wèn)題實(shí)驗(yàn)室有認(rèn)證、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)人員有許可證有標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程MOPS、質(zhì)控/質(zhì)評(píng)簽發(fā)臨檢報(bào)告要慎重、留余地可靠性和及時(shí)性兼?zhèn)?72022/10/23基因診斷和產(chǎn)前基因診斷中的知情同意和倫理樣品的采集與保存對(duì)象

保存環(huán)境

保存期限白細(xì)胞/皮膚細(xì)胞*低溫≤?20C°1年EBV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞系*凍存液氮無(wú)限組織冰凍?80C°3年毛發(fā)(帶毛囊)低溫≤?20C°1年口腔脫落細(xì)胞低溫≤?20C°1年DNA高鹽冷藏4C°10年RNA全血(抗凍劑)低溫?20/?80C°1年/3年蛋白粗提物低溫≤?70C°半年*白細(xì)胞可經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化建立永生細(xì)胞株，皮膚成纖維細(xì)胞可培養(yǎng)永久保存無(wú)限擴(kuò)增2022/11/158樣品的采集與保存對(duì)象還有很重要的，樣本庫(kù)2022/11/1完整有用的樣本一定要有專業(yè)的數(shù)據(jù)庫(kù)：臨床和背景資料齊全有編號(hào)、易檢索（條形碼管理）納入合適的樣本庫(kù)保存條件合格無(wú)降解無(wú)污染數(shù)據(jù)庫(kù)要素：病人一般資料臨床特點(diǎn)家族資料樣品管理家系調(diào)查網(wǎng)絡(luò)組59還有很重要的，樣本庫(kù)2022/10/23完整有用的樣本一定要構(gòu)成小型樣本庫(kù)的硬件和軟件每臺(tái)立式冰箱：16～20個(gè)耐酸鋁架;20個(gè)蠟紙or塑料盒/架;9×9凍存管/盒=25920～32400管標(biāo)本(3.5ml)條形碼打印機(jī)耐低溫標(biāo)簽掃碼槍2022/11/160構(gòu)成小型樣本庫(kù)的硬件和軟件每臺(tái)立式冰箱：16～20個(gè)耐酸鋁架大型標(biāo)本庫(kù)的構(gòu)成與核心區(qū)域規(guī)劃：緩沖區(qū)核心：庫(kù)區(qū)監(jiān)控室樣本接收區(qū)樣本處理區(qū)輔助功能區(qū)：用品庫(kù)、辦公室、更衣室2022/11/161大型標(biāo)本庫(kù)的構(gòu)成與核心區(qū)域規(guī)劃：2022/10/236162是多功能的大型實(shí)驗(yàn)室：研究教學(xué)臨床基因診斷標(biāo)本庫(kù)實(shí)驗(yàn)中心大樓位于北大醫(yī)院門(mén)診南側(cè),7層,面積7000m2CentrallaboratoryResearchTeachingClinicalgeneticdiagnosisBioBank簡(jiǎn)介：北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心（中心實(shí)驗(yàn)室）2022/11/162是多功能的大型實(shí)驗(yàn)室：簡(jiǎn)介：北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心2063臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室

StandardPCRLaboratory300m2,strictlymanagedinCAPwayNegative

pressuredoublesystems100,000levelcleanLabStrict

functions

and

workflowtoavoidPCRcontamination:ReagentStore&Prepare→DNAsampling→PCR→PCRproductanalysis→Sequencing→DatamanagingWayInWayOut2022/11/163臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室

StandardPCRLab64臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室

LicencesPCRLaboratory:No.1inBeijingforInheriteddiseasePrenataldiagnosis642022/11/164臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室LicencesPCRLabo65臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室Management

Rules

and

regulationsSOPSamplemanagement:barcodeAdvancedequipment2022/11/165臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室ManagementRules

66臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室

LaboratoryfacultiesResearcher:5perDoctor:2Technician:7Ph.D.:2M.D.:2Master’s:4Bachelor’s:4Others:2AllPCRandprenatalcertificates2022/11/166臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室

Laboratoryfacul產(chǎn)前診斷項(xiàng)目(30%檢出異常)NIPTforDown’s脊肌萎縮征(SMA)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson’s)苯丙酮尿癥(PKU)四氫生物蝶呤缺乏癥(PTPS)Rett綜合征結(jié)節(jié)性硬化(TSC)常染色體顯性遺傳多囊腎(ADPKD)遺傳性多發(fā)梗死癡呆病(CADACIL)X-腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(X-ALD)異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、腎胚瘤(RB)葉酸利用能力(MTHFR)軟骨發(fā)育不全(X線和B超提示)耳聾相關(guān)基因(芯片法)甲狀腺素抵抗綜合征唇腭裂相關(guān)基因(DiGeorge等)流產(chǎn)、畸形等全基因組劑量分析(byarrayCGH智力低下和發(fā)育落后(byMLPA)21種微缺失綜合征……線粒體病、視神經(jīng)病、抗生素所致耳聾8位點(diǎn)檢測(cè)，均是國(guó)內(nèi)檢測(cè)最全最徹底的672022/11/167產(chǎn)前診斷項(xiàng)目(30%檢出異常)NIPTforDown’s我們對(duì)遺傳病的了解以及基因診斷的臨床應(yīng)用是“冰山一角”還是“盲人摸象”？謝謝！不孕癥病因2022/11/168我們對(duì)遺傳病的了解以及基因診斷的臨床應(yīng)用謝謝！不孕癥病因20遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段進(jìn)展北大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心戚豫研究員2022/11/169遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段進(jìn)展北大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心2022/10/22007,Illumina推出Solexa;ABI推出SOLid…均能在3天內(nèi)完成1人的全基因組測(cè)序2022/11/1702007,Illumina推出Solexa;ABI推出SO2022/11/1遺傳病和基因的數(shù)量？遺傳病總數(shù)：14,861種(Online-MendelianInheritanceinMan,OMIM,by2015-3-21)人類基因總數(shù)：≥24,000個(gè)人類各種結(jié)構(gòu)和功能蛋白：100,000種89種表型和基因全清楚；4,381種表現(xiàn)找到致病突變——意味著可做直接的基因診斷的病種很少！已知序列：10,391個(gè)基因——可做間接診斷的很多！712022/10/23遺傳病和基因的數(shù)量？遺傳病總數(shù)：14,8“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因?yàn)橐磺腥梭w正常生理功能和病理狀態(tài)都是由基因決定的狹義：因基因突變而引發(fā)的疾病如何區(qū)分三個(gè)概念：

遺傳性疾?。号c環(huán)境因素引起的疾病對(duì)立

先天性疾?。嚎梢允菄a(chǎn)期感染/藥物所致

家族性疾病：可能隨著成員的遷出而終止2022/11/172“遺傳病”概念廣義：所有疾病。因?yàn)橐磺腥梭w正常生理功能和病發(fā)病頻率——總計(jì)占我國(guó)出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每一項(xiàng)只占萬(wàn)分之幾到千分之幾按系統(tǒng)分類排名前5位：神經(jīng)系統(tǒng)：智力低下、代謝障礙、癲癇心血管系統(tǒng)：先心病內(nèi)分泌系統(tǒng)：糖尿病、腎上腺皮質(zhì)增生生殖系統(tǒng)：不孕不育骨骼系統(tǒng)：多指/趾-并指/趾、軟骨發(fā)育不良2022/11/173發(fā)病頻率——總計(jì)占我國(guó)出生人口5.6%；為全球平均5～7倍每2022/11/1先天性疾病的誘發(fā)因素遺傳原因后天環(huán)境所致，因素：物理：X-ray、微波、超聲波、熱化學(xué)：砷、鉛、汞（水俁?。┑葻o(wú)機(jī)物；橙劑、EB（溴乙啶）等有機(jī)物生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等圍產(chǎn)期因素誘變，但不肯定致病圍產(chǎn)期因素只侵犯到個(gè)別器官，但注意與嵌合遺傳（mosaic）區(qū)分742022/10/23先天性疾病的誘發(fā)因素遺傳原因62022/11/1如何檢出？高危人群環(huán)境暴露既往病史家族史感染史遷居情況……遺傳DNA/RNA

環(huán)境無(wú)論外來(lái)病原體還是本身異常，遺傳物質(zhì)的檢測(cè)都是有效手段752022/10/23如何檢出？高危人群遺傳2022/11/1實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段,分辨率,

和范圍染色體核型Karyotyping:109bp,2800倍鏡下可見(jiàn)熒光原位雜交FISH:107bp,一個(gè)基因的一部分多重探針連接擴(kuò)增MLPA:105bp,幾十個(gè)基因比較基因組雜交CGHArray:105bp,幾個(gè)基因間接基因診斷:103~105bp,一個(gè)或數(shù)個(gè)基因直接基因診斷PCR-Sequencing:1bp,一個(gè)基因Affymatricchip:1bp,數(shù)千個(gè)基因,半個(gè)基因組Genome-Wide-Sequencing:1bp,全部2.4萬(wàn)個(gè)基因注：bp,basepair,堿基對(duì)762022/10/23實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段,分辨率,和范圍染色體2022/11/1從核型;FISH;arrayCGH;MLPA;

到CMA(chromosomalmicroarrayanalysis,染色體微陣列,分子核型)——細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)相結(jié)合的方法臨床細(xì)胞遺傳學(xué)的歷史是伴隨著一系列識(shí)別染色體方法的技術(shù)進(jìn)步發(fā)展臨床細(xì)胞遺傳學(xué)基本工作：核型分析國(guó)內(nèi)主要中期染色體核型，G顯帶在400條國(guó)外高分辨染色體核型，G顯帶在1500條條件：細(xì)胞培養(yǎng)，光鏡，核型分析系統(tǒng)軟件772022/10/23從核型;FISH;arrayCGH2022/11/11、染色體核型Karyotyping

——基于顯微鏡下濃聚的染色體形態(tài)檢查方法：

G帶、R帶、Q帶（550條，7組）高分辨染色體分帶（>1500條）

FISH（熒光原位雜交）：分裂間期染色體畸變種類：數(shù)目異常（整倍和非整倍）結(jié)構(gòu)異常:-;+;t;del;ins;inv;dup;invdup;fra(X)(q27.3):脆性X;der:衍生染色體;r(13):13號(hào)染色體呈環(huán)狀（暗示有缺失）;i(Xq):等臂Xq782022/10/231、染色體核型Karyotyping

2022/11/12、熒光原位雜交技術(shù)FISH(fluorescenceinsituhybridization,)可以結(jié)合，但不依賴于核型分析單色與多色FISH，如SKY-FISH(光譜式多色染色體)是鑒別基因組發(fā)生較大缺失或重復(fù)金標(biāo)準(zhǔn)不足：一次雜交識(shí)別的范圍有限——需要很好的臨床診斷或其他提示，花費(fèi)大人力多，設(shè)備高級(jí)方法：探針標(biāo)記，細(xì)胞或染色體的原位雜交條件：探針(cosmid)、DNA提取、PCR、真空干燥、圖像采集與分析792022/10/232、熒光原位雜交技術(shù)FISH(fluo2022/11/1FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析系統(tǒng)802022/10/23FISH需要條件——熒光顯微鏡+圖像分析2022/11/13、多重探針連接擴(kuò)增MLPA(multiplexligation-dependentprobeamplification)

SchoutenJP第一次描述一種基于PCR反應(yīng)，通過(guò)毛細(xì)管電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物是一種高分辨的，用于檢測(cè)基因組序列拷貝數(shù)變異的方法(NucleicAcidsRes.2002Jun15;30(12):e57)

812022/10/233、多重探針連接擴(kuò)增MLPA(mu2022/11/1

同時(shí)檢測(cè)40個(gè)基因組序列異常，幾乎每個(gè)染色體2個(gè)近端粒常有微缺失涉及不育、發(fā)育、智力，可一次查全僅需要20ng的DNA

能檢測(cè)單個(gè)外顯子exon的拷貝數(shù),

探針辨認(rèn)短的基因組序列,部分變性的DNA,如石蠟包埋,甲醛固定的樣本均可使用相對(duì)定量40個(gè)mRNA,鑒定啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài),檢測(cè)已知的突變和SNPS

MLPA方法功能、特點(diǎn)

822022/10/23同時(shí)檢測(cè)40個(gè)基因組序列異常，幾乎每個(gè)2022/11/1MLPA反應(yīng)過(guò)程832022/10/23M152022/11/1MLPA結(jié)果判定相對(duì)峰域與對(duì)照相比減少35-50%判定缺失相對(duì)峰域與對(duì)照相比增加35-50%判定重復(fù)突變/多態(tài)性位于探針的連接點(diǎn)或與探針的連接點(diǎn)很近也可能導(dǎo)致相對(duì)峰域減少單一的外顯子缺失需要其他方法證實(shí)結(jié)果分析2例842022/10/23MLPA結(jié)果判定相對(duì)峰域與對(duì)照相比減少32022/11/1852022/10/23172022/11/1862022/10/23182022/11/1MLPA

需要條件PCR儀測(cè)序儀872022/10/23MLPA

需要條件PCR儀192022/11/14、比較基因組雜交

(Comparativegenomichybridization,CGH)什么是CGH:1992年Kallioniemi創(chuàng)立的基于熒光標(biāo)記和分子、細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)鑒定基因組DNA的獲得、丟失和擴(kuò)增，并且可以把這些遺傳變異定位在正常的中期染色體上的一種技術(shù)特點(diǎn):在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用一張中期染色體涂片分析全基因組的大的DNA序列拷貝數(shù)的不平衡改變(獲得和丟失)，即因劑量的變化而不需要分裂的細(xì)胞缺點(diǎn):與測(cè)序相比分辨率不高，擴(kuò)增子約2Mb，檢出的缺失大小5～10Mb——但也是個(gè)優(yōu)點(diǎn)：容易辨識(shí)和解釋

1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH目前最通用的是美國(guó)安捷倫公司(Agilent)的平臺(tái)，已成為國(guó)際上遺傳病診斷、流產(chǎn)組織分析和種植前診斷PGD的第一線手段(first-line)882022/10/234、比較基因組雜交(Comparati2022/11/1MicroarrayBACs/PACsDNA探針固定在玻璃片上ArrayedbyroboticallyprintingDNAontoslidesAgilentscannerOldarray-CGH892022/10/23MicroarrayOldarray-2022/11/1Patient2ThispatientpresentedtotheLaboratoryat12monthsofagewithinfantilespasmsanddevelopmentaldelay.Hisheadcircumferencewasbelowthe2ndcentileandweightwasbetweenthe10to25thcentile.Seizurescontinueddaily.Atareviewat32monthsbrachycephaly,lowanteriorhairline,hypertelorism,andalargeprotrudingtongueweresomeoftheadditionalfeaturesobserved.SubtelomericFISHrevealedadeletionofthedistal9qprobePAC112N13.Array-CGHshowedthepatienthasa1.5-1.8Mbdeletionofdistal9q.FurtherFISHevaluationestablishedthedeletionas1.7MbwithbreakpointsbetweentheBACclonesRP11-83N9andRP11-695L17.902022/10/23Patient2222022/11/111qduplication

10qdeletionPatient5Malepatientwhopresentedat18yearsofagewithintellectualdisability,autismanddysmorphicfeatures.SubtelomereFISHshowedaunbalancedtranslocation,withanadditionalcopyofthe11qprobePAC770G7presentondistal10q.Thedistal10qprobePAC137E24Gwasnotpresent.912022/10/2311qduplication10q2022/11/1Newarray-CGH?用不同的顏色熒光標(biāo)記等量病人的測(cè)試和參照DNA加入HumanCot1DNA在Microarray上進(jìn)行雜交

雜交后洗去未結(jié)合的和錯(cuò)配的靶DNA高分辨掃描儀芯片922022/10/23Newarray-CGH?用不同的顏色2022/11/1雙色激光掃描紅色CY5綠色CY3F值產(chǎn)生

referenceDNApatient=932022/10/23雙色激光掃描reference=25真實(shí)掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/11/194真實(shí)掃描芯片圖(8X60K芯片)分析軟件界面2022/10Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列出部分）2022/11/195Cytoreport:給出23條染色體圖和分析表格（列2022/11/1什么是基因診斷？狹義：針對(duì)致病基因的突變分析——是一種直接的診斷擴(kuò)展：利用致病基因的多態(tài)性(polymorphism)；或利用相鄰的多態(tài)性標(biāo)記(polymorphicmarkers)進(jìn)行連鎖分析——是一種間接的診斷廣義：通過(guò)對(duì)疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，包括復(fù)制(DNA)、表達(dá)(RNA)和翻譯(蛋白質(zhì))加以全過(guò)程分析所做出的診斷962022/10/23什么是基因診斷？狹義：針對(duì)致病基因的突變2022/11/1基因診斷技術(shù)基礎(chǔ):PCR聚合酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreaction,PCR):1985年發(fā)明,1992諾貝爾獎(jiǎng)試管在熱循環(huán)儀(PCR儀)中反應(yīng)幾小時(shí)，待測(cè)基因片段，專一地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍PCR過(guò)程：加熱變性：分開(kāi)模DNA雙鏈冷卻復(fù)性：使引物與目標(biāo)序列特異結(jié)合保溫延長(zhǎng)：使引物按模板序列延長(zhǎng)972022/10/23基因診斷技術(shù)基礎(chǔ):PCR聚合酶鏈反應(yīng)(2022/11/1PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR反應(yīng)場(chǎng)所以及982022/10/23PCR產(chǎn)物檢測(cè)PCR反應(yīng)場(chǎng)所2022/11/1不適合做PCR診斷的病種染色體病大片段基因缺失和重排所致的遺傳?。?/p>

解決辦法：細(xì)胞遺傳學(xué)，熒光原位雜交FISH、多重探針連接擴(kuò)增MLPA、比較基因組雜交CGH、基因芯片Affymatricarray和大規(guī)模全基因組測(cè)序……基因巨大(Megabases)且無(wú)熱點(diǎn)突變的遺傳?。篘F1、DMD、BMD、ADPKDetc.

解決辦法：雜交、酶學(xué)、代謝產(chǎn)物、功能分析，截短蛋白分析法(ProteinTruncationTest,PTT)、色譜、串聯(lián)質(zhì)譜……992022/10/23不適合做PCR診斷的病種染色體病312022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需要查閱OMIM遺傳病數(shù)據(jù)庫(kù)()1002022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——需2022/11/1哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診斷適用范圍和必要性有器官組織差異性而不適合做組織活檢的遺傳?。簂ongQT等心臟病、糖原累積癥I型(vonGierke型)、癲癇等腦病……診斷后可以治療或提前預(yù)防發(fā)病的遺傳?。喝鏟KU、肝豆?fàn)詈俗冃院虶6PD缺乏癥……可以進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的嚴(yán)重的先天代謝病，嚴(yán)重的精神疾患或惡性早期致死性疾?。喝缧詣e畸形和性發(fā)育異常而找不到染色體異常。可通過(guò)選擇性流產(chǎn)加以預(yù)防傳統(tǒng)方法不能診斷、診斷不確切的家族性疾病：多以常顯、X連鎖和母系方式遺傳?？勺鲞B鎖分析1012022/10/23哪些遺傳病可以做基因診斷?

——基因診2022/11/1例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對(duì)氨基甙類如卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素以及鏈霉素等超級(jí)敏感條件致病——使用氨基甙類藥物母系遺傳——線粒體DNA上編碼12SrRNA的基因存在致病突變A1555G一旦發(fā)現(xiàn)，可對(duì)全家進(jìn)行該突變的篩查發(fā)布用藥禁忌1022022/10/23例如:家族性氨基甙類藥物耳聾對(duì)氨基甙類如2022/11/1Ⅲ-1(先證者)Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-4

A>G:＋

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＋＋線粒體mtDNA1555A>G基因診斷(＋：有突變)II-1Ⅱ-2Ⅱ-3Ⅱ-4氨基甙類耳毒家系的基因診斷示意圖I-1I-21032022/10/23Ⅲ-1(先證者2022/11/1例2線粒體病的基因診斷mitochondrion線粒體是細(xì)胞的能量工廠…1042022/10/23例2線粒體病的基因診斷mitochon2022/11/1Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴(yán)重性：在我院兒科臨床診斷的35例中，死亡29例（83%）。目前生存僅僅6例。Leigh病是一種線粒體病，但僅僅有20%由mtDNA突變突變所致，80%由核基因突變所導(dǎo)致?；驒z查：mtDNA突變檢出率極低——229臨床診斷病例中僅僅檢出3例：T8993C2例和T8993G1例（死后尸解結(jié)果mtDNAMut%：血=85%;肌肉=94%;腦=98%；其母外周血=10%）1052022/10/23Leigh病-亞急性壞死性腦脊髓病嚴(yán)重2022/11/1病例1、臨床表現(xiàn)男，4月，主因精神發(fā)育倒退、驚厥入院第一胎，孕9月疑潛在性缺氧行剖宮產(chǎn)，生后無(wú)窒息；2月內(nèi)發(fā)育如常，后出現(xiàn)倒退，表現(xiàn)為頸部發(fā)軟、四肢活動(dòng)差、吸吮能力減弱、低熱、陣發(fā)性呼吸暫停（2~8次/日）檢查：間斷抽搐，四肢肌力、肌張力低下，病理征(-)。血乳酸高、代謝性酸中毒。EEG示左側(cè)為主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。MRI示缺血改變：雙側(cè)殼核、丘腦區(qū)異常信號(hào)；腦白質(zhì)發(fā)育落后。兩次眼底檢查未見(jiàn)異常呼吸節(jié)律不整，死前突然出現(xiàn)嘆氣樣呼吸…父31歲、母30歲，均無(wú)遺傳病家族史1062022/10/23病例1、臨床表現(xiàn)男，4月，主因精神發(fā)育倒2022/11/11072022/10/23392022/11/11082022/10/23402022/11/1方法PCR擴(kuò)增mtDNA8791-9413片段(622bp)分別用限制性內(nèi)切酶MspI和SmaI酶解PCR產(chǎn)物2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶解片段對(duì)EB染色的片段進(jìn)行密度掃描，突變比例（Mut%）=突變新增片段密度/原有片段殘留密度+突變新增片段密度結(jié)果患兒體內(nèi)存在高比例的8993T>G突變患兒1親屬中母親含較低比例的同樣突變患兒1肌和腦組織病理檢查符合嬰兒型Leigh綜合征診斷患兒1MRI示腦缺氧性改變M

患兒肌肉患兒血母親陰性對(duì)1092022/10/23方法結(jié)果M患兒肌肉患兒血母親2022/11/1患者L1以第1對(duì)引物擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果T8993GT8993C患者L2以第1對(duì)引物擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果1102022/10/23患者L1以第1對(duì)引物擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物直接2022/11/1患者CT和死后尸解1112022/10/23患者CT和432022/11/1病理改變：灰質(zhì)為主的海綿樣改變，神經(jīng)細(xì)胞壞死和毛細(xì)血管增生。陳舊病變出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，新鮮病變存在格子細(xì)胞。腦干黑質(zhì)、舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核和前庭神經(jīng)核在不同病人均受累。其他部位病變可以僅限于腦干，也可以同時(shí)累及脊髓灰質(zhì)、基底節(jié)、大腦和小腦皮層以及白質(zhì)。1122022/10/23病理改變：灰質(zhì)為主的海綿樣改變，神經(jīng)細(xì)胞2022/11/1“間接法”基因診斷——連鎖分析

例：苯酮尿癥(PKU)的診斷致病基因：苯丙氨酸羥化酶PAH方法：細(xì)菌抑制實(shí)驗(yàn)(篩查)

苯丙酮酸和PAH定量基因診斷困難

70多種突變基因大，突變很分散檢測(cè)突變成本高，周期長(zhǎng)直接檢測(cè)突變或連鎖分析?1132022/10/23“間接法”基因診斷——連鎖分析

2022/11/1連鎖分析方法產(chǎn)前診斷PKU

——選擇幾對(duì)染色體標(biāo)記(marker)

←A

←B

連鎖分析示意圖需要多態(tài)性標(biāo)記（與PAH基因在染色體上的距離越近越好）對(duì)先證者(BB)及家系成員(父-AB;母-BC;胎兒-AC)的標(biāo)記進(jìn)行分型(genotyping)胎兒-AC：不受累！連鎖診斷準(zhǔn)確度：marker與致病基因的連鎖程度——有1%的交換率，理論可信度為99%←C

1142022/10/23連鎖分析方法產(chǎn)前診斷PKU

——選擇幾對(duì)2022/11/1產(chǎn)前基因診斷對(duì)象：胎兒的DNA、代謝產(chǎn)物或酶蛋白取材：絨毛(8周)、羊水(16周)、胎兒靜脈血手段：針對(duì)代謝產(chǎn)物：HPLC、GC-MS(有組織特異性)

酶活性：特異性人工底物顯色(有組織特異性)

針對(duì)基因：RFLP、PCR等(無(wú)組織特異性)要求：雙取樣、雙方法、有資質(zhì)、有質(zhì)控準(zhǔn)入：目前北京7家，專家委員會(huì)審核和年審管理:《北京市產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前篩查工作規(guī)范》《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》1152022/10/23產(chǎn)前基因診斷對(duì)象：胎兒的DNA、代謝產(chǎn)物體細(xì)胞嵌合的遺傳病（生殖細(xì)胞嵌合異常比例過(guò)低也不行）組織器官異質(zhì)性過(guò)大（線粒體?。﹪?guó)家法律和行業(yè)規(guī)定不允許的范圍，如“天才基因”兒的選擇（遺傳不平衡）性別鑒定（除非性連鎖疾?。┏蕯?shù)量遺傳的多基因病或遺傳相關(guān)的復(fù)雜遺傳病以及沒(méi)有做好準(zhǔn)備的家庭……2022/11/1哪些病不適合產(chǎn)前基因診斷116體細(xì)胞嵌合的遺傳病（生殖細(xì)胞嵌合異常比例過(guò)低也不行）2022

非侵入性產(chǎn)前檢查NIPT——血漿游離DNA突變檢測(cè)技術(shù)

TTTTCTTTTCc.2383C>Tc.2383C>Tc.4005delGc.4005delGG2671**2022/11/1117非侵入性產(chǎn)前檢查NIPTTTTTCTTTTCc.2383母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetalcf-DNAdetectedviaYchromosome,Lancet1997胎兒游離DNA：cell-freefetalDNA(cffDNA)母體外周血含有cffDNA，幾乎全部來(lái)源于胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞。懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。（7周建立胎兒胎盤(pán)循環(huán)）。cffDNA片段比較小，長(zhǎng)度在75bp和250bp之間。母體外周血中的cffDNA含量在5%到30%之間。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。與母親體重有關(guān)。產(chǎn)后2hr之內(nèi)消失。2022/11/1118母體血漿中的胚胎DNALoYMetal.Fetal22條常染色體23條常染色體20%胚胎

DNA380%2胎兒80%母親染色體非整倍體導(dǎo)致劑量變化2022/11/111922條常染色體23條常染色體20%胚胎DNA380%2胎技術(shù)和科學(xué)的目標(biāo)

thatgovernmentofthepeople,bythepeople,forthepeople,shallnotperishfromtheearth.————byAbrahamLincoln2022/11/1120技術(shù)和科學(xué)的目標(biāo)thatgovernmentofth基因診斷的制高點(diǎn)——多基因病：

能否靠基因芯片或微陣列解決？Randomarrayofclusters100um2022/11/1121基因診斷的制高點(diǎn)——多基因?。?/p>

能否靠基因芯片或微2022/11/1劃時(shí)代的新技術(shù)——大規(guī)模二代測(cè)序NGS(NextGenerationSequencing)

人類基因組計(jì)劃長(zhǎng)達(dá)10年、耗資千億、6國(guó)數(shù)萬(wàn)科學(xué)家投入，僅完成4個(gè)人的基因

2007年：1人，3天內(nèi)，3000美元，費(fèi)用和時(shí)間在以每年遞減一半的速度下降——取代所有一切，40種常見(jiàn)病發(fā)表。。。多基因病時(shí)代來(lái)了？SOLEXA_illumina1GGenomeAnalyzer1222022/10/23劃時(shí)代的新技術(shù)——大規(guī)模二代測(cè)序NGS(2022/11/1InstrumentwithoutCoversFluidics&electronicsFlowcell&detectionLaseroptics1232022/10/23InstrumentwithoutC2022/11/