纖維素酶法提取黃芪總黃酮的工藝研究

纖維素酶法提取黃芪總黃酮的工藝研究【摘要】目的優(yōu)選黃芪總黃酮的提取工藝。方法用正交設(shè)計法討論了影響纖維素酶法提取黃芪中總黃酮的主要因素,并確定了最正確提取工藝。結(jié)果纖維素酶法提取黃芪總黃酮的最正確工藝條件為:酶解時間為120in，酶解溫度為30℃，酶量為8g，pH值為4.5。結(jié)論此工藝簡單可行,是一條提取黃芪總黃酮類物質(zhì)的有效途徑。【關(guān)鍵詞】纖維素酶黃芪總黃酮正交設(shè)計法Abstrat：bjetiveTptiizetheextratintehnisfrttalflavnidsfrAstragalus.ethdsTherthgnaldesignasndutedtinvestigatetheainellulseenzyatiextratinfttalflavnidsfrAstragalusandthebestextratintehnisasdeterined.ResultsTheptiunditinsellulseenzyatiextratinfttalflavnidsfrAstragalusereasflls:enzylysistie120in,hydrlysisteperature30℃,enzyevlue8g,PHvalue4.5.nlusinThisethdissipleandfeasible.ItisaneffetiveayfrextratinfttalflavnidsfrAstragalis.Keyrds：ellulase;Astragalus;Ttalflavnids;rthgnaldesign黃芪為豆科植物蒙古黃芪AstragalusTehnlgy或膜夾黃芪Astragalusebranaeus的枯燥根,具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等成效。黃芪中的主要有效成分為多糖、皂苷和黃酮類化合物,其中黃酮類化合物主要包括毛蕊異黃酮(alysin)及其糖苷芒柄花素(frnnetin)和芒柄花苷(nnin)等［1］。研究證實黃芪中的黃酮類成分具有多種藥理活性,具有去除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、增強免疫力、抗病毒以及促進細胞增殖的作用［2～3］。近年來，酶技術(shù)應(yīng)用于中草藥有效成分的別離提取獲得了不少新的成果，尤其應(yīng)用纖維素酶可破壞細胞壁的致密構(gòu)造，加速藥用有效成分的溶出，進步藥用有效成分的提取率。酶解過程的本質(zhì)是通過酶解反響促進傳質(zhì)過程。纖維素酶是一組可以降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。纖維素是黃芪細胞壁的主要成分，亦是胞內(nèi)黃酮等大分子溶出的主要屏障，利用纖維素酶水解細胞壁，利于胞內(nèi)成分溶出［4～9］。但將纖維素酶應(yīng)用于提取黃芪中總黃酮的研究鮮見報道。本實驗將上海伯奧生物科技提供的綠色木酶〔主要成分為纖維素酶，以下簡稱纖維素酶〕用于黃芪總黃酮的提取，應(yīng)用正交設(shè)計優(yōu)化酶法提取黃芪總黃酮的工藝條件，討論各因素對黃芪總黃酮提取率的影響，以期到達進步提取率、縮短提取時間、減少能耗和有效保存黃芪總黃酮的生物活性，并為植物酶技術(shù)在中藥有效成分的提取方面的應(yīng)用提供根據(jù)。1儀器與試劑1.1儀器HH-6恒溫水浴鍋〔江蘇金壇市宏華儀器廠〕；RE-52S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪予華儀器廠)；予華牌循環(huán)水真空泵(河南省鞏義市英峪予華儀器廠)；UV1101紫外/可見分光光度儀(上海天美科學(xué)儀器)；AY120電子分析天平〔日本島津公司〕；KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲清洗器〔昆山禾創(chuàng)超聲儀器〕；搖擺式高速中藥粉碎機(大德中藥機械)。1.2試劑乙醇〔無水乙醇〕；5%亞硝酸鈉；10%硝酸鋁；4%氫氧化鈉；乙酸〔冰醋酸〕；無水乙酸鈉；蘆丁對照品〔中國藥品生物制品檢定所，批號:050923〕,黃芪購自廣州致信中藥飲片，纖維素酶(活性單位≥15U／g)由上海伯奧生物科技提供。2方法與結(jié)果2.1黃芪總黃酮成分提取稱取纖維素酶8g，用pH=4.5的HA-NaA緩沖液10l混合后與1g黃芪粉末〔過50目篩〕混合均勻，在30℃下處理1h后加95％的乙醇20l，在70℃下浸提1h過濾，用20l體積分數(shù)85％的乙醇洗滌殘渣過濾，合并濾液，回收乙醇，殘渣溶于質(zhì)量分數(shù)為85%的乙醇，定容至25l，精細汲取1l于25l的容量瓶中，30%乙醇定容,得供試品溶液。2.2黃芪總黃酮含量的測定2.2.1蘆丁對照品溶液的制備準確稱取于蘆丁對照品10g,置于50l容量瓶中,加30%的乙醇30l,超聲使之溶解,冷卻至室溫,并稀釋至刻度,搖勻,得濃度為200μg/l的蘆丁對照品溶液,冷藏,備用。2.2.2吸收波長的選擇對照品測定波長確實定：取對照品溶液1l，按標(biāo)準曲線項下的方法進展，在400～700n波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在500n波長處為最大吸收。樣品測定波長確實定：取樣品的乙醇提取液1l，按標(biāo)準曲線項下的方法進展，在400～700n波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在500n波長處有最大吸收。2.2.3標(biāo)準曲線制備精細稱取蘆丁對照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0l分別至25l容量瓶中，分別參加5%亞硝酸鈉溶液0.3l，搖勻，放置6in，參加10%硝酸鋁溶液0.3l，放置6in，參加1l氫氧化鈉溶液4l，分別用30%的乙醇定容，放置15in，置比色皿中，在500n波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。經(jīng)回歸統(tǒng)計，得標(biāo)準曲線方程：A=0.0109-0.0013，r=0.9998。濃度在0～400μg/l范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3黃芪中總黃酮提取率的測定取黃芪中總黃酮提取液用紫外分光光度計于500n下測出吸光度A代入以下回歸方程式及以下公式，計算出黃芪中總黃酮的提取率。提取率〔%〕=〔×V×10-6〕，式中V為定容體積〔l〕，為黃芪藥粉質(zhì)量〔g〕，為黃芪提取液濃度〔μg/l〕。2.4單因素實驗及正交實驗酶法提取的整個工藝分為酶解和浸提兩局部，準確稱取黃芪1g，參加緩沖溶液和一定比例的酶，黃芪經(jīng)酶解后在一樣的條件下浸提，過濾，按標(biāo)準曲線方法測定吸光度。2.4.1考察酶解溫度對總黃酮提取率的影響稱取纖維素酶8g，用pH=4.5的HA-NaA緩沖液10l混合后與1g黃芪粉末〔過50目篩〕混合均勻，分別在30，35，40，45，50，55℃下處理1h后加95％的乙醇20l，在70℃下浸提1h過濾，用20l體積分數(shù)85％的乙醇洗滌殘渣過濾，合并濾液，回收乙醇，殘渣溶于質(zhì)量分數(shù)為85%的乙醇，定容至25l，精細汲取1l于25l的容量瓶中，30%乙醇定容，按標(biāo)準曲線操作測定總黃酮含量。繪制單因素圖見圖1。由于一般纖維素酶的活性多在40～60℃較好，因此考察酶解溫度為30，40，50，60，70℃對黃芪中總黃酮提取率的影響。由圖1可知，在40℃以下總黃酮的提取率隨溫度的升高而增大，溫度為40℃時，黃芪總黃酮提取率最大，隨后溫度進一步升高黃芪總黃酮收率逐漸減小，溫度在60℃，70℃時提取率穩(wěn)定，趨向一致。這是因為40℃時纖維素酶發(fā)揮最大活性，有利于黃酮類化合物的溶出，進步黃芪總黃酮提取率。而溫度進一步進步，那么不利于酶活力的發(fā)揮，溫度過高會使酶蛋白變性失活，喪失催化才能，因此提取效果變差。2.4.2考察酶解時間對總黃酮提取率的影響稱取纖維素酶8g，用pH=4.5的HA-NaA緩沖液10l混合后與1g黃芪粉末〔過5目篩〕混合均勻，在45℃下分別處理30，60，90，120，150in后加95％的乙醇20l，在70℃下浸提1h，過濾定容方法同上，單因素圖見圖2。從圖2中可知，隨著酶解時間的延長，總黃酮的提取率也隨著進步，當(dāng)酶解2h即可到達最正確效果，在2h之前，延長酶解時間可明顯進步總黃酮提取率，但在2.5h實驗時的總黃酮的提取率僅比2h略高，說明酶解已經(jīng)根本完成，沒有再增加酶解時間的必要。2.4.3考察酶用量對總黃酮提取率的影響分別稱取纖維素酶4，6，8，10，12g，用pH=4.5的HA-NaA緩沖液10l混合后與1g黃芪粉末〔過5目篩〕混合均勻，在45℃下處理1h后參加95%的乙醇20l，在70℃下浸提1h。過濾定容方法同上，其單因素圖見圖3。由圖3可看出，在酶用量在8g之前，隨著酶用量的增大，總黃酮的提取率逐步進步，酶用量到8g之后，總黃酮的提取率上升趨勢不明顯。纖維素酶用量對酶解用一定的影響，在一定的酶濃度范圍內(nèi)，隨著酶量的增加，纖維素酶解率增大。由于一定量的纖維素在一定條件下，纖維素分子能和酶分子結(jié)合的結(jié)合點數(shù)有限當(dāng)這些結(jié)合點全部被纖維素酶分子占據(jù)后，再增加纖維素酶用量，起不到酶解作用，而從經(jīng)濟角度考慮，酶用量也要盡可能的少。因此最正確的酶用量為8g。2.4.4正交實驗上面討論了各單因子的影響，但是在實際的操作中，各因素是互相交差影響的。因此，為全面考察影響因素，設(shè)計了4因素3程度正交實驗，結(jié)果見表1～2。從表2的K值和極差R值可以看出，在4個影響總黃酮提取率的因素中，影響順序為：酶解溫度〔B〕＞酶量〔〕＞酶解時間〔A〕。其中A3B13為最正確優(yōu)化條件，即酶解時間為120in，酶解溫度為30℃，酶量為12g，pH值為4.5。經(jīng)測定，在此最優(yōu)工藝條件下，黃芪中總黃酮的提取率為0.402%。比擬初步優(yōu)化和正交優(yōu)化的結(jié)果可以看出，兩者的條件根本不同。原因可能在于4個主要因素互相影響，有互相作用。表1正交實驗的因素及程度，表2酶法提取黃芪中總黃酮的正交實驗結(jié)果〔略〕。3討論實驗結(jié)果說明，酶解時間的延長、酶量的適當(dāng)加大、適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H值有利于進步黃芪有效成分提取率。各因素對總黃酮的提取率的影響大小次序先后為：酶解溫度＞酶量＞酶解時間。各因素的優(yōu)化工藝參數(shù)為：A3B13,即酶解時間為120in，酶解溫度為30℃，酶量為12g，pH值為4.5。在此最優(yōu)工藝條件下，黃芪中總黃酮的提取率為0.402%。如“2.4.3〞項結(jié)果，在本實驗參數(shù)的根底上，為了獲得較高的提取率、節(jié)省酶用量，酶用量取8g。此工藝簡單可行,是一條提取黃芪總黃酮類物質(zhì)的有效途徑。纖維素酶是一組可以降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。黃芪細胞的細胞壁主要由纖維素構(gòu)成，纖維素酶可以將其水解為葡萄糖，使其內(nèi)容物更容易被提取出來。纖維素酶只是破壞黃芪細胞的細胞壁，其細胞內(nèi)部物質(zhì)并不含有纖維素類物質(zhì)，因此纖維素酶對其內(nèi)容物的成分沒有任何影響。中草藥種類繁多，有效成分構(gòu)造復(fù)雜。為了進步中草藥有效成分的提取率，可應(yīng)用酶法提取中藥有效成分。隨著酶技術(shù)在中草藥有效成分提取方面研究的不斷深化，應(yīng)用纖維素酶、果膠酶以及復(fù)合酶進步中草藥藥用有效成分的提取率，將成為充分利用中草藥資源的有效途徑，酶技術(shù)必將在中藥現(xiàn)代化進程中發(fā)揮重要作用?！緟⒖嘉墨I】［1］姚美村,齊瑩,畢開順,等.黃芪藥效物質(zhì)根底研究［J］.中國野生植物資源,2000,19(2):361.［2］汪德清,田亞平,宋淑珍,等.黃芪總黃酮抗突變作用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