RNA原位核酸雜交方法

RNA原位核酸雜交方法一、基本原理RNA原位核酸雜交(RNAnucleicacidhybridizationinsitu)又稱RNA原位雜交組織化學(RNAinsituhybridizationhistochemistry)或RNA原位雜交[6,7,25](RNAinsituhybridizationRISH)。該技術是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術經不斷改進，其應用的領域已遠超出DNA原位雜交技術。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學技術，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學的一重要方向。RNA原位雜交不同于DNA原位雜交主要有：(1)使用的探針不同：RNA原位雜交中多采用RNA或寡核苷酸探針，因此避免了應用雙鏈DNA探針在雜交反應中存在的兩條鏈之間的復性和第二條鏈的競爭性雜交問題。cRNA-RNA之間形成的雜交體要比DNA-DNA、cDNA-RNA雜交體性能穩(wěn)定，在雜交反應后可用RNA酶洗脫，以除去未結合的探針，因此特異性更強。(2)檢測的目的不同：RNA原位雜交檢測和分析的主要為內源性基因，包括細胞內固有基因、異?；蚝妥儺惢?。以正確反映組織與細胞之間相互關系及功能和代謝狀態(tài)、探索疾病發(fā)病機理、觀察治療的療效和評估疾病的預后等。其次為對外源性基因檢測，以獲得病毒和細菌類型等病原學診斷。而DNA原位雜交主要為外源性基因檢測。(3)有較高的靈敏度：在檢出細胞和組織內在低拷貝核苷酸時，RNA原位雜交能獲得較好定位，而DNA原位雜交則難以信任。但RNA原位雜交也存在某些不足之處，為使RNA原位雜交標準化和克服其不足之處必須注意以下幾點：(1)不同探針種類的選擇、制備和標記要適合靶核酸和組織的特點；(2)有效制止組織和細胞內RNA降解；(3)實驗流程中嚴防RNA酶污染；(4)對雜交信號有效的放大和顯色技巧；(5)陽性結果判別，不僅需要有陽性和陰性標本對照，有條件的更需要觀測Northern雜交和免疫組化對同一組織的冰凍切片和石蠟切片中，基因及其產物兩者表達之間聯系。(6)在實驗流程的各個技術環(huán)節(jié)中熟練運用技術控制是保證RNA原位雜交成功的必要條件。近幾年來RNA原位雜交已得到穩(wěn)步發(fā)展。主要表現在：非同位素標記的探針制備和標記技術的進步、雜交信號放大的應用、組織預處理的改進、RNA原位雜交和免疫組化雙重檢測技術和激光共聚焦顯微鏡在多重RNA原位雜交中應用等。從理論上講，RNA原位雜交已趨成熟和完善，關鍵是在實際應用中能否被人們所受接并應用到各學科的研究中，促進人們對各類基因識別和表達規(guī)律的認識。二、RNA原位雜交中的探針探針的種類RNA探針是指帶有標記的能與組織內相對應的核苷酸序列互補結合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據在RNA雜交中所使用的探針依其來源可分為三種：即特異性cDNA.cRNA探針和人工合成寡核苷酸探針。單鏈cDNA探針：由于cDNA中不存在內含子及其它高度重復序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應中兩條鏈之間復性的缺點，從而提高了雜交反應的敏感性。但由于單鏈cDNA探針的制備比較困難，在RNA原位雜交中已很少見有應用。cRNA探針：是以cDNA為模板，通過體外轉錄而獲得的。因為它是一種單鏈探針，因此也避免了應用雙鏈cDNA探針做雜交反應時存在的兩條之間的復性問題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩(wěn)定。cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應后可用RNA酶處理，以除去未結合的探針。由于cRNA探針具有以上這些優(yōu)點，cRNA探針的雜交飽和水平又比雙鏈DNA探針高出8倍，因此在原位雜交中應用廣泛。cRNA探針的缺點是：探針的制備過程比較復雜，需要較好的分子生物學實驗設備，它對RNA酶敏感，易受破壞，操作中要謹防RNA酶污染。寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成，避免了真核細胞中存在的高度重復序列帶來的不利影響。由于大多數寡核苷酸序列較短，不需要純化，組織穿透性極好。根椐目的基因的特異性序列設計的探針，特異性較強。合成的寡核苷酸探針的缺點是：探針長度必須適宜，探針太長可造成內部錯誤配對雜交，探針太短可形成非特異性結合。它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標記物少，敏感性較低。依標記物不同，探針又可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。前者主要包括3H、 35C、32P和1251等，不同的同位素探針其穿透力，定位和半衰期各不相同，無一種同位素探針具有穿透力強、定位好和半衰期長所有優(yōu)點。由于半衰斯短，性能不穩(wěn)定，污染環(huán)境和危害健康等原因，在RNA原位雜交中應用同位素標記探針已日趨減少，而非同位素標記探針在近年來得到迅速發(fā)展，其標記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標記等。其中地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點，其應用越來越廣泛。（二）探針的標記在RNA原位雜交中，不僅要選擇適當的探針，而且還要使探針得到有效的標記。探針標記法有酶反應法和化學反應法。酶反應法：用于RNA探針的酶反應法主要為末端標記法與體外轉錄法。末端標記法是將標記物導入線型DNA或RNA的5'端或3'端的一種標記法，末端標記適用于合成寡核苷酸探針的標記，用末端標記制備的探針一般攜帶的標記分子較少。體外轉錄法：體外轉錄法是一種制備與克隆片段序列相同的單鏈RNA探針的方法。進行體外轉錄時，先將靶核苷酸序列克隆到含噬菌體轉錄啟動子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板，以含有標記的三磷酸苷為原料，對啟動子下游的序列進行轉錄，而啟動子本身并不被轉錄。體外轉錄常用噬菌體轉錄啟動子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體T3、T7。當兩個不同的噬菌體轉錄啟動子結合在載體多克隆位點的兩側，用適當的限制性內切酶在插入序列的下游將質粒線性化。SP6噬菌體的RNA聚合酶對SP6啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動下游的轉錄，在4種三磷酸核糖核苷和相應的噬菌體RNA聚合酶存在的條件下，即轉錄成RNA。如反應物中含有標記的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被標記。依標記物為同位素和非同位素，近年來非同位素標記探針已有了極大的近步。常用非同位素標記技術有生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素。非同位素標記法又可分為直接標記法和間接標記法。直接標記法是將標記物直接結合到探針上，當探針與組織內相應靶核苷酸結合后，即可顯色觀察。這類標記探針必須符合標記物在雜交過程中不丟失，又不影響雜交反應為條件。大量已發(fā)表的文獻表明，由于檢出雜交信號受到多種因素制抑，只能限于靶RNA豐富的細胞或組織中，RNA雜交對低拷貝的基因檢測不理想。近年來間接標記法得到較快發(fā)展，先將標記物結合在探針上，通過特異性抗體識別，由特異性抗體結合多種酶，對檢測的雜交信號作有放大，這一類標記法已展示極好的發(fā)展前景。（三） 探針的純化某些標記探針必須經純化后方可使用。這是因為在探針標記過程中，反應液中仍存在一些未被結合到探針中去的剩余dNTP等小分子。為將摻入并結合到cDNA、cRNA和標記寡核苷酸與游離的標記寡核苷酸分開，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法進行純化。乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未摻入DNA的dNTP則保留在上清液中，由此反復乙醇沉淀能將兩者分開。核酸溶液中去除蛋白質的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質變性劑，以增加去除蛋白質雜質的效果。因為酚雖能有效地變性蛋白質，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，從而溶解一部分ploy（A）RNA。為克服這兩方面的局限，混合使用酚與氯仿，對于RNA提取，顯得更加重要，氯仿還能加速有機相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。（四） 雜交前準備載玻片和蓋玻片的處理為有效防止外源性RNA酶的污染，雜交用的載玻片和蓋玻片可按以下步驟處理。將載玻片和蓋玻片分別浸泡在5%潔消精（蘇洲吳縣化工二廠）中12小時，用35°C-40°C溫水中沖洗30min,再用雙蒸水漂洗3次，每次5min,室溫下干燥切片后，在180C烤箱內烘烤4－6小時，蓋玻片可按近期內所需量，用鋁箔紙包裹后烘烤后存放。為防止組織或細胞標本在雜交過程中漂起或脫落，載玻片應涂以粘附劑，大的冰凍或石蠟切片建議用明膠粘附劑，活檢或較小的標本建議用多聚左旋賴氨酸或硅烷粘附劑。明膠涂片制備取10克明膠（Merck）溶于1000毫升40C—50C雙蒸水中，待明膠完全溶解后加入4毫升25%硫酸鉻鉀溶液（chromiumpotassiumsulfateCPS），使CPS的終濃度為0.1%。將烘烤后的載玻片浸泡在明膠溶液中10min,在室溫下干燥玻片。再將載玻片浸泡在含有1%多聚甲醛，PH7.4的PBS溶液中10min；在室溫下干燥玻片后再將載玻片浸泡在含有1%多聚甲醛，PH7.4的PBS中10min,在室溫下干燥玻片。60C烤箱內過夜備用。多聚左旋賴氨酸涂片的制備取2-4mg多聚左旋賴氨酸（Sigma）,分子量在300000以上，溶于1ml消毒去離子水中。經旋渦器反復攪拌，吸取20-30pl滴加到玻片一側，再取另一張載玻片復合，將賴氨酸溶液均勻涂抹在裱組織切片處，并將涂有粘附劑的一面用鉆筆標出，室溫下干燥切片后，在60°C烤箱內過夜備用。硅烷涂片的制備取5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)(Sigma)溶于250ml丙酮內。將烘烤后的載玻片浸泡硅烷溶液中60min,用雙蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60C烤箱內過夜備用。注意事項：載玻片的粘附劑及涂片制備，以組織切片或細胞不脫落，不干擾雜交信號，低背景，經濟及制備方便為原則，在制備過程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮膚上孤NA酶的污染。多聚左旋賴氨酸溶液的溶度可按實際應用效果調整，并應注意有效期限，制備載玻片應盡快使用，防止賴氨酸解聚而失效。新鮮標本的儲存和冰凍切片制備為RNA原位雜交作新鮮標本儲存和冰凍切片過程中，應嚴防RNA酶的污染，制備過程中所使用的容器、刀具等均經高壓消毒或清潔后用0.1%焦碳酸二乙酯(DiethylpyrocarbonateDEPC)水清洗。為防止RNA迅速降解，標本離體后，先切成1.5x1.2cm大小，其厚度不超過0.2cm，應迅速投入4%多聚甲醛溶液內，置4C冰箱內2-4小時。再將組織移入30%蔗糖PBS溶液內，4C冰箱內過夜。次日可將標本儲存于-80C或-140C超低溫冰箱內保存。如作冰凍切片，先將組織在-20C恒冷切片機內停留，待溫度回升后，然后在恒冷冰凍切片機內切成7pm薄片。40C烤箱內干燥切片2小時后儲存在-80C或-140C超低溫冰箱內備用。標本的固定和石蠟切片的制備石蠟切片作RNA原位雜交的，也應嚴防RNA酶的污染、容器、刀具等去除RNA酶的過程同冰凍切片。為防止RNA迅速降解，離體后標本應立即有效固定。為保存良好組織結構，有利探針的穿透力，應選用合適的固定劑。常用的化學固定劑可分為，沉淀固定劑和交聯固定劑兩類。前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等。經沉淀固定劑固定的組織通透性較好，利于探針穿入，但過長時間固定，可引起RNA降解。其不足之處是：組織形態(tài)結構的保持不如交聯固定劑。交聯固定劑能較好保存組織中RNA和組織形態(tài)結構，但固定時間過長，也可發(fā)生胞漿和胞核內大分子化合物形成交聯，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。4%多聚甲醛固定液取4g多聚甲醛和0.25g甘氨酸分別溶于100ml0.01mol/LPH7.0PBS溶液，組織在常溫下浸泡于4%多聚甲醛中4小時，每1小時將組織在真空下吸干10min,再注入新的固定液，共4次。然后用0.01mol/LPH7.0的PBS漂洗2次，每次30min。福爾馬林醋酸固定液福爾馬林醋酸固定液由50%酒精、10%福爾馬林和5%醋酸組成。在常溫下將組織浸泡4小時，每1小時在真空下吸干10分鐘，再注入新的固定液，共4次，然后用50%酒精漂洗2次，每次30min。雜交前探針的選擇RNA探針：RNA探針的長度以50-150堿基為佳，探針易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。長500個堿基的探針雜交時間約需20個小時左右，如超過500個堿基的RNA探針則在雜交前用有限堿基水解法控制其長度。孵育時間t=Lf-Lo/KxLoxLf(Lo=核酸探針原長度(kb),Lf=核酸探針水解后所需長度(kb),K是常數率=0.11kb/min)。在室溫中加入下列試劑終止水解：3mol/L醋酸鈉，6.6川(終濃度0.1mol/L),醋酸1.3川(終濃度為0.5%)。加入下列試劑沉淀探針：7mol/L醋酸銨100川，100%乙醇750|jl,RNA(10mg/ml)2川，置-20°C2小時后恢復到室溫，在1400rpm離心30min。小心將乙醇倒出，待試管內干燥后再用無菌ddH2O稀釋到10ng/pl濃度。最終探針長度可于10%聚丙稀酰胺凝膠在60C的尿素中電泳檢測。探針的長度原位雜交反應中探針濃度應超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為背景著色度高低與探針濃度有關。最佳探針濃度是最低探針濃度達到靶核酸的最大飽和結合度為目的。探針濃度按其種類而略有不同，放射性標記cRNA探針的濃度為0.5ng/pl，而非放射性標記cRNA探針的濃度1.0ng/pl。雜交液的量要適當，每張切片以30-50pl為宜。保持雜交液不流失的關鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應用雜交罩等也很必要。雜交的溫度和時間設置和調整雜交溫度是RNA原位雜交的重要環(huán)節(jié)。雜交溫度應低于解鏈或融解溫度(meltingtemperatureTm)20-30C。多數RNA原位雜交Tm為95C，由于這一溫度對保存組織形態(tài)完整和組織切片的粘附將產生不利影響，為此在雜交液中常以增加甲酰胺濃度來降低Tm值，因為每增加1%甲酰胺濃度可降低0.72C。另外雜交體中GC的百分比，雜交體長度以及雜交液中Na+的濃度也與Tm呈正相關。雜交反應的時間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時間過短會造成雜交不完全，雜交時間過長會增加非特異性著色。一般RNA原位雜交采用雜交孵育過夜，在黑暗環(huán)境下進行，可以避免光線對甲酰胺的電離作用。三、cRNA探針檢測組織切片中的RNA原位雜交組織的前處理冰凍切片的制備：(1)離體后組織應切成1.5x1.2cm，厚度為0.2cm。(2)立即投入4%多聚甲醛溶液中(PBS新配制)，4C下固定2-4小時。(3)倒去固定液后，加入30%蔗糖溶液(PBS新配制)，4C下過夜，次日將組織塊儲存在-80C或-140C超低溫冰箱內。(4)或將組織塊置于-20C恒冷切片機內切成10pm薄片，粘附于涂有粘附劑的載玻片上置室溫下，置40C恒溫箱內過夜，或置40C恒溫箱內至少2小時，后將切片放入切片盒在-80C超低溫冰箱內存放備用。組織的固定和石蠟切片的制備：(1)離體后組織切成不大于1.5x1.2cm、厚0.2cm。(2)立即投入4%多聚甲醛溶液內(PBS新配制),或2.5%戊二醛，在室溫下固定3-4小時。(3)用PBS沖洗，經梯度酒精脫水、二甲苯透明和浸蠟包埋切片。(4)切成5pm薄片粘附于涂有粘附劑的載玻片上，在40°C恒溫箱內過夜干燥切片，用新的二甲苯脫蠟2x10min和100%、95%、70%、各級酒精1x5min,ddH2O漂洗2x5min。注意事項切除的新鮮標本應立即作組織固定或低溫儲存，以免mRNA降解。標本盡可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰凍切片,這一制備法既能避免mRNA降解，又能保持良好的組織形態(tài)。對外檢病例中，采用10%福爾馬林固定標本的，為利于mRNA檢測，固定時間不要超過36小時，以免引起RNA與蛋白質之間發(fā)生交聯。在冰凍切片和石蠟切片制作過程中，所使用的容器、器械都要經高壓消毒，或清潔后用0.1%DEPC水清洗，再經ddH2O沖洗，避免外源性RNA酶污染。RNA探針的標記RNA探針的制備需將cDNA探針克隆到帶有RNA多聚酶啟動子的質粒，然后轉錄制成RNA探針。用EDTA緩沖液和DEPC處理的ddH2O將會影響RNA多聚酶中的質粒。RNA探針的長度應V500bp,>500bp的探針不易與mRNA形成雜交體。對探針標記、預雜交、雜交和后雜交流程中使用的容器、ddH2O均需經0.1%DEPC處理，為避免RNA酶污染，操作人員必須戴手套和口罩操作。RNA探針的純化：①在雜交探針中加入5pl10%乙酸(aceticacicl),11pl3mol/L醋酸納PH6.0，1pl10mg/mltRNA，1.2pl1mol/LMgCl2,300pl冷酒精。②在-20C孵育4-16小時。③在4C下15min,使RNA發(fā)生沉淀。④真空下干燥RNA沉淀物。⑤用DEPC處理的ddH2O含標記的RNA探針10—50pg/ml。RNA探針的水解：按以下方法減少探針長度為近200bp，在Microcentrifuge管內加入50plRNA探針標記液，力口入30pl200mmol/LNa2CO3和20pl200mmol/LNaHCo3。將雜交探針置于60C條件下，按以下方法計算水解時間，t=(L0—Lf)/(K.LO.Lf)(L0=RNA探針原長度(kb),Lf=RNA探針水解后所需長度，K=常數率(K=0.11kb/min),t=水解時間)。預雜交(1)切片用DEPC處理的PBSPH7.4(140mmol/LNaCl,2.7mmolKCl,10mmol/LNa2HPO4,1.8mmol/LKH2PO4)孵育2x5min,再用DEPC處理的含100mmol/L苷氨酸(Glycine)PBS孵育切片2x5min°(2)用DEPC處理的含0.3%TritonX-100PBS孵育15min。(3)用DEPC處理的PBS漂洗2x5min。(4)冰凍切片用TE緩沖液(100mmol/LTris-HCl,50mmol/LEDTAPH8.0)不含RNA酶的1pg/ml蛋白酶K,在37C下通透切片30min。石蠟切片用TE緩沖液配制的不含RNA酶的5-20pg/ml蛋白酶K,在37C下通透切片30min。(5)在4C下用DEPC處理的4%多聚甲醛PBS溶液作后固定5min。(6)再用DEPC處理的PBS沖洗切片2x5min。(7)切片作酸酐處理，處理液含0.25醋酸酐、0.1mol/L三乙醇胺(TriethanolamineTEA)PH8.0,振蕩漂洗2x5min。(8)在37°C孵育切片后，雜交緩沖液沖洗(含50%去離子甲酰胺的4xSSC)，至少10min。注意事項切片的通透化是RNA原位雜交關鍵步驟，特別對回顧性資料尤為重要，因固定液種類和固定時間的不同，需作最佳通透化條件探索，包括蛋白酶K濃度，孵育時間20-30min之間調整，甚至采用0.2mol/LHCL配制的0.1%胃蛋白酶。由于醋酸酐極不穩(wěn)定，宜將醋酸酐在使用前加到TEA緩沖液中。1xSSC=150mmol/LNaCl,15mmol/LsodiumcitratepH7.2。原位雜交(1)雜交液(40%去離子甲酰胺、10%葡聚糖、1xDenhardt's、0.02%Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、10mg/ml去RNA酶的牛血清、4xSSC、10mmol/LDTT、1mg/ml變性的剪切鮭魚精子DNA)的準備。(2)瀝干后用雜交緩沖液漂洗，并沿組織周邊擦干，每張切片滴加30pl探針雜交液(內含5-10ng非同位素標記cRNA探針)。(3)用24x30mm雜交罩(hydrophobicplasticcoverslip)復蓋雜交組織。置42C濕盒內過夜。注意事項：雜交液應新配制，并在-20C下儲存，新配制雜交液能使用幾個月。雜交后處理(1)揭去雜交罩將切片浸泡于2xSSC中5-10min。(2)在37C用2xSSC2x15min、1xSSC2x15min振蕩漂洗。(3)為消除未雜交單股cRNA探針，在37C含RNA酶A的NTE緩沖液(500mmol/LNaCl,10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,PH8.0)中漂洗30min。(4)置37C用0.1xSSC振蕩漂洗2x30min。注意事項在同一容器中不能同時放入含不同探針切片。(2)如果雜交的背景較高，非特異性信號較多，可采用52C含5%甲酰胺的2xSSC洗脫。雜交后顯色(1)用BufferAPH7.5(100mmol/LTris-Hcl,150mmol/LNaCl)振蕩漂洗切片2x10min。(2)每張切片滴加封閉液40pl(含0.1%TritonX-100和2%正常羊血清的BufferAPH7.5)。(3)抖去封閉液，每張切片加羊抗地高辛抗體AKP結合物30pl(BufferA內含0.1%TritonX-100,1%正常羊血清，羊抗地高辛抗體AKP結合物)在溫盒內2小時。(4)用BufferA振蕩漂洗切片2x10min。(5)用BufferBPH9.5(100mmol/LTris-Hcl,100mmol/LNaCl，50mmol/LMgCl2)孵育切片10min。(6)顯色液配制：用10mlBufferBPH9.5，內含45|jl硝基四氮唑藍(NitrobluetetrazoliumNBT)(75mg/mlNBT,70%二甲基甲酰胺)，35pl5—溴一4—氯一3—吲哚基一磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indoly卜phosphateBCIP)或X-Phosphate(50mgX-Phosphate/ml,100%二甲基甲酰胺)。(7)每張切片200pl顯色液，在黑暗條件下顯色2-24小時。(8)顯色滿意后用BufferCPH8.1(10mmol/LTris-Hcl,1mmol/LEDTA)沖洗漂洗切片。(9)ddH2O中止反應。(10)用0.02%亮綠或0.1%核固紅復染細胞核1-2min。(11)用自來水洗2x10min。(12)用即用型(GvaMount)水溶性封片劑封片。注意事項顯色液的配制：10mlBufferBPH9.5溶液中含有45plNBT(70%二甲基甲酰胺中含有75mg/1mlNBT)，35plBCIP或X-磷酸鹽(100%二甲基甲酰胺中含有50mg/mlX-磷酸鹽)，1mmol/L左旋咪唑(levamisole)(2.4mg/10ml左旋咪唑Sigma)?？沟馗咝量贵w一AKP的最佳濃度探索可采用同一雜交切片，用1:100、1:500和1:1000抗體濃度比較之。如果顯色液中用1mmol/L左旋咪唑的濃度，仍然發(fā)現內源性磷酸脂的活性較高(背景色)，左旋咪唑的濃度可以增加到5mmol/L。NBT/BCIP顯色液后雜交切片，不能用二甲苯透明和溶二甲苯的封片劑。滴加雜交液和顯色液應防止流失，除標記切片放平整之外，很重要的原因之一與載玻片的清潔度有關。用DAKO魔筆沿組織周圍劃圈，在雜交反應中既可省略雜交罩、又可在顯色反應中防止反應液外溢。四、用寡核苷酸探針檢測組織切片中的RNA原位雜交用寡核苷酸探針檢測組織切片中相關的mRNA(靶核苷酸)是較為常見的RNA原位雜交。這是因為寡核苷酸探針不僅具有能按靶核苷酸序列設計與特定的靶基因結合，而且以核苷酸為原料通過DNA合成儀合成。寡核苷酸探針方法簡便，探針一般較短組織穿透性好，無須進一步純化等優(yōu)點外，而且易于在組織切片內檢測靶mRNA的一種理想的原位雜交探針。作者運用生物素及地高辛標記的寡核苷酸探針，對17例新鮮乳腺癌組織分別作了RNA原位雜交和Northern雜交。冰凍切片中RNA原位雜交，ERmRNA陽性率64.6%(11/17),PRmRNA為58.9%(10/17),而Northern雜交中ERmRNA陽性率為76.5%(13/17)、PRmRNA陽性率為64.7%(11/17)。上述兩種雜交中ERmRNA陽性、陰性符合率分別為58.7%和17.7%,PRmRNA為47.1%和23.5%。在此基礎上作者還對278例乳腺癌分別作了RNA原位雜交和免疫組化對照檢測。石蠟切片中RNA原位雜交，ERmRNA、PRmRNA的陽性率分別為67.3%和61.9%，高于同一組織切片中免疫組化的ER52.9%和PR的41.8%,ERmRNA、PRmRNA的陰性率為32.7%和38.1%，又低于同一組織切片中免疫組化的ER47.1%和58.2%。ERmRNA與ER的陽性及陰性符合率分別為48.6%和28.1%，ERmRNA陽性而ER陰性的占18.7%,ERmRNA陰性而ER陽性的僅占4.3%。PRmRNA與PR的陽性及陰性符合率分別為39.6%、35.9%，PRmRNA陽性的而PR陰性的占22.3%，PRmRNA陰性而PR為陽性的僅占2.2%。經結合臨床隨訪和組織學分級、淋巴結轉移等，得到理想結果?，F將原位雜交實驗流程介紹如下：(一)組織的前處理對組織預處理所用的刀具及容器作清潔處理和滅活RNA酶。將外科或動物實驗切取標本切成S1.2x1.0x0.2cm組織塊立即冷凍在液氮內儲存，或用4%多聚甲醛(用新鮮0.05mol/LPH7.4PBS配制)或中性福爾馬林(ddH2O配制，PH7.0)固定，固定時間以24-36小時為宜，避免RNA降減或固定過度。為獲得高雜交信號，冰凍切片應切成10pm,切片內如含有脂肪組織應在氯仿內孵育5min,以得到好的切片背景，并干澡切片。石蠟切片厚度為5—7pm，用無RNA酶的防切片脫落的載玻片貼附組織切片。石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精處理（100%、95%、80%）至水化（ddH203x5min）。（二） 雜交的預處理在37°C恒溫箱內干燥切片后，滴加5-10pg/ml蛋白酶K,置37°C濕盒內孵育30min,ddH203x5min或4°C75%酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。0.25%醋酸酐10min,經70C2xSSC漂洗、40°C2xSSC各漂洗15min,2xSSC3min,切片經75-100%酒精梯度脫水。注意事項蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探針的可結合性。蛋白酶K濃度過低，不能使靶核酸有效暴露，濃度過高則組織消化過度，也會影響檢測結果。蛋白酶K須用蛋白酶K緩沖液配制（0.1mol/LTris-HClPH8.0,50mmol/LEDTA,經高壓滅菌后備用）,蛋白酶K應新鮮配制，低溫冰箱內分裝保存。蛋白酶K消化組織切片是原位雜交實驗流程中重要環(huán)節(jié)，蛋白酶K濃度應力求準確無誤。根據組織類型、固定液的種類，固定時間和切片的厚薄的不同，蛋白酶K濃度也存在差異，選用蛋白酶K最佳消化濃度是原位雜交成功的必要條件，不可省略。（三） 寡核苷酸探針選擇和標記常用的寡核苷酸探針對已知靶RNA序列而設計的。特定序列的單一寡核苷酸探針，能與靶mRNA區(qū)段的部分序列完全或基本相配對，其長度為19-24核苷酸。這類探針多采用對其5'端進行磷酸化實現。探針通常無須純化，但是較長的寡核苷酸探針，各片段可能受到污染，應通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法將污染的片段除去。（四）預雜交將DEPC處理的切片經ddH2O漂洗2x5min。準備雜交液（3xSSC,1xDenhard's液（0.02%（W/V）Ficoll,0.02%（W/V）小牛血清，0.02%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone）,10%（W/V）葡聚糖，125pg/ml酵母tRNA,100pg/ml變性和剪切的硅魚精子DNA,10pg/mlPolyadenylcytidyicacid，50%甲酰胺,20mmol/L焦磷酸納PH7.2）。按組織片大小，每張切片滴加40pl雜交液，置37C溫盒內2小時。（五）雜交抖去甩干雜交溶液，用DAKO魔筆沿組織周圍劃圈，滴加30pl探針雜交液/每張切片（內含20ng地高辛標記的探針），在44C濕盒內孵育過夜。注意事項寡核苷酸探針雜交條件，既要保證雜交特異性的嚴格性，又要具有能在適當速率下形成穩(wěn)定雜交體的松動性。一般情況下，用合成寡核苷酸進行雜交的條件要比雜交體的解鏈溫度（Tm）值降低5—10C。這一條件可以減少短探針雜交可能造成假陽性的殮基錯配，也會使完全配對的雜交體形成速率降低。短寡核苷酸與靶序列形成的雜交體極易解體，雜交后漂洗必須盡快進行。在使用靶序列完全配對的單一寡核苷酸探針時，雜交條件極易從雜交體的Tm值推得。對短于18個核苷酸的寡核苷酸，將雜交體中A殘基數與T殘基數和乘以2°C,再將殘基G與C殘基數的和乘以4C,兩積相加便得出雜交體的Tm值。但對于含有較長寡核苷酸的雜交體，采用此法結算的Tm值偏高。注意事項去離子甲酰胺的濃度（deionizedformamidedF）為47%,過高和過低甲酰胺的濃度都會影響雜交結果，當去離子酰胺濃度高于或低于47%,應加ddH2O調整，并根據Longetal1992年報導，計算去離子甲酰胺百分比公式為：％dF=%GC=寡核苷酸G+C殮基量的百分比，L=寡聚核苷酸探針長度，％mismatch=寡核苷酸不能與靶核苷酸配對殮基的百分比，47=雜交溫度+10C（在37C下）。雜交液內加入變性剪切的鮭魚精子DNA在雜交前加入，與其它雜交液分開儲存。雜交液能在一20C保存幾個月。（六） 雜交后處理1.將切片置37C2xSSC中漂洗2x10min。 2.在37C2xSSC漂洗2x15min、IxSSC漂洗2x15min、0.25xSSC漂洗2x15min均需用振蕩漂洗切片。（七） 免疫檢測及顯色BufferAPH7.5（0.1mol/LTris，1mol/LNaCl，2mmol/LMgCI2,500|jlTween20）沖洗、漂洗各3x5min。用DAKO魔筆沿組織周圍劃圈，每張切片滴加Streptavidin-AP（鏈菌素抗生物素-堿性磷酸酶）抗體30pl（1pg/ml）,置37C溫盒內1小時。BufferBPH9.5（0.1mol/LTris,1mol/LNaCl,5mmol/LMgCl2）沖洗、漂洗各3x5min。BufferCPH9.5（0.1mol/LTris,0.1mol/LNaCl,5mmol/LMgCl2）沖洗、漂洗各3x5min。每張切片滴加50-100|jl顯色液（1mlBufferCPH9.5內含0.33mgNBT+0.16mgBCIP,1mmol/L左旋咪唑在黑暗條件下顯色20-40min,顯微鏡下控制效果。ddH2O中止反應。用核固紅復染1-3min,次日在在37C恒溫箱內干燥切片15min后，單張切片快速經二甲苯，中性樹膠封片。（八）陽性信號的評定原位雜交的陽性信號位于漿內，經NBT/BCIP顯色，陽性信號為藍色，呈細顆粒狀。信號越強,顏色越深,呈藍紫色和紫黑色。陰性對照片內無陽性信號檢出。原位雜交的陽性等級按以下方法計算：陽性細胞數：陽性細胞S10%、S30%、＜70%和〉70%分別計1、2、3和4分。陽性著色強度：雜交信號強度可分為弱、中、強三級分別計1、2和3分，上述兩種計分相加,1-3分者為陰性,4-5分者為陽性,6-7分者為強陽性。（九）原位雜交的對照原位雜交流程中陰性對照設定:在ERmRNA、PRmRNA的陽性組織片中,在雜交過程中加雜交液不加探針，在免疫檢測中不加Streptavidin-AP等，其結果均為陰性。注意事項陽性對照對已知含有豐富靶mRN