DB37-T 4053-2020 新城疫病毒基因VII型熒光定量PCR檢測方法-（高清版）

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DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T4053—2020Real-timePCRassayforthedetectionofgenotypeVIInewcastlediseasevirus202007092020Real-timePCRassayforthedetectionofgenotypeVIInewcastlediseasevirus2020070920200809山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學家禽研究所。本標準主要起草人：孟凱、吳家強、宋敏訓、袁小遠、張玉霞、楊金興、艾武、王友令、亓麗紅。新城疫病毒基因VII型熒光定量PCR檢測方法范圍本標準規(guī)定了新城疫病毒基因VII型（NDV）熒光定量PCR檢測方法。本標準適用于雞咽喉和泄殖腔拭子及腦、肺臟、脾臟等組織中新城疫病毒基因VII型的檢測。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法劇減弱。隨著PCR反應的進行，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。4試劑或材料除非另有說明，在分析中僅使用分析純的試劑，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。10PBS：pH7.2RNA劇減弱。隨著PCR反應的進行，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。4試劑或材料除非另有說明，在分析中僅使用分析純的試劑，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。10PBS：pH7.2RNASYBRGreenIRT-PCRMLVRNaseInhibitor。DNA1.0×105拷貝/μLDEPC5儀器設備10μL、20μL、100μL、1000μL16000r/min。5.3PCR4.0℃～99.95.40.01g。5.5-205.6引物ForwardPrimer：5’-CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3’ReversePrimer：5’-GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3’注：Y=C或T；R=A或G；K=G或T樣品棉拭子，剪刀，鑷子，1.5mL離心管。3（2U/mL2mg/mL）10×PBS（pH7.2）1.5mL霉素10000U/mL+鏈霉素10mg/mL）的PBS中。7.2.2組織樣品待檢禽無菌采集腦、肺臟、脾臟等組織，裝入一次性采樣袋或其他滅菌容器，編號。h霉素10000U/mL+鏈霉素10mg/mL）的PBS中。7.2.2組織樣品待檢禽無菌采集腦、肺臟、脾臟等組織，裝入一次性采樣袋或其他滅菌容器，編號。h-20℃冰箱保存。/15m4500r/min離心10min1.5mL（:1P400r/min離心10min1.5mL8試驗步驟8.1病毒RNA提取提取RNA時應避免RNA酶污染。同時設立陽性對照和陰性對照。用病毒RNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取待檢樣品RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2熒光定量PCR反應體系詳見表1。表1熒光定量PCR反應體系試劑使用量酶混合物*0.4μLDNA聚合酶0.4μLSYBRGreenIRT-PCRBuffer**10μLPCRForwardPrimer(10μmol/L)0.4μLPCRReversePrimer(10μmol/L)0.4μLTotalRNA2.0μLDEPC水6.4μLTotal20μL每次均應設陰性對照。*內含MLV反轉錄酶和RNA酶抑制劑。8.3熒光定量PCR反應程序設定詳見表2。表2熒光定量PCR反應程序設定9結果判定8.3熒光定量PCR反應程序設定詳見表2。表2熒光定量PCR反應程序設定9結果判定閾值設定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點為準。Ct（Cp）A.1）Ct（Cp）35，（A.2）陰性階段1：反轉錄反應階段2：PCR反應階段3：溶解曲線分析42℃，15min95℃，5sec95℃，5sec95℃，10sec60℃，45sec（收集熒光）65℃，5sec1Cycle40Cycle95℃，5sec無Ct（或Cp）值并且無擴增曲線，表明樣品中無基因VII型新城疫病毒核酸。陽性83.5VII（A.3）Ct（或Cp）值＞35的樣品須復檢，重做結果無Ct值者為陰性，否則為陽性。/r/