細(xì)胞重組與細(xì)胞融合課件

第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院細(xì)胞重組與細(xì)胞融合細(xì)胞重組：從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組份，在體外進(jìn)行重新裝配成為具有生物活性的細(xì)胞的一種技術(shù)。細(xì)胞融合：人工方法使2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞合并形成1個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞重組與細(xì)胞融合細(xì)胞重組：從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組份，核體與胞質(zhì)體核體：與細(xì)胞質(zhì)分離后得到的帶有少量細(xì)胞質(zhì)并包有質(zhì)膜的細(xì)胞核，也成為小型細(xì)胞。核體能夠重生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長(zhǎng)分裂。胞質(zhì)體：除去細(xì)胞核后由質(zhì)膜包裹的無(wú)核細(xì)胞。細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)胞排核反應(yīng)，此時(shí)通過(guò)離心的方法可以將核體與胞質(zhì)體分離。核體與胞質(zhì)體微細(xì)胞微細(xì)胞：又稱微核體，含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。秋水仙素和長(zhǎng)春新堿等有絲分離阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期染色體產(chǎn)生發(fā)散運(yùn)動(dòng)，發(fā)散開(kāi)的染色體各自裝配出自己的核膜，形成微細(xì)胞。秋水仙胺細(xì)胞松弛素B細(xì)胞松弛素B離心微細(xì)胞秋水仙胺細(xì)胞松弛素B細(xì)胞松弛素B離心胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的重組形成胞質(zhì)雜種；微細(xì)胞與完整細(xì)胞的重組形成微細(xì)胞核異體；胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞。細(xì)胞重組的方式胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的重組形成胞質(zhì)雜種；細(xì)胞重組的方式細(xì)胞重組技術(shù)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)建不同類型的雜種細(xì)胞提供可能；細(xì)胞重組技術(shù)可以人為的將染色體或者基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使重組細(xì)胞產(chǎn)生新的性狀和新的特性。細(xì)胞重組的意義細(xì)胞重組技術(shù)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)工程：是研究真核細(xì)胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細(xì)胞質(zhì)工程是進(jìn)行細(xì)胞重組的重要基礎(chǔ)。細(xì)胞質(zhì)工程涉及的技術(shù)有：1、細(xì)胞破碎2、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離3、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移4、胞質(zhì)雜種細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)工程：是研究真核細(xì)胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細(xì)胞器、一、細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)胞破碎方法包含：1、超聲波破碎法2、反復(fù)凍融法3、高速組織搗碎法4、化學(xué)裂解法5、生物酶解法一、細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液，由發(fā)生器和換能器組成。反復(fù)凍融法將細(xì)胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。超聲波破碎法高速組織搗碎法借助高速組織搗碎機(jī)使細(xì)胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片打碎?；瘜W(xué)裂解法通過(guò)化學(xué)藥品改變細(xì)胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法利用溶解細(xì)胞壁的酶處理細(xì)胞，破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含組分釋放。高速組織搗碎法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離細(xì)胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不同，因此，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法將細(xì)胞內(nèi)各種組份分級(jí)分離出來(lái)。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離過(guò)程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步。細(xì)胞勻漿要在低溫條件、等滲緩沖液（等滲勻漿介質(zhì)，如0.25mol/L的蔗糖）中進(jìn)行。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離方法包含：1、差速離心法2、密度梯度分離法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離細(xì)胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合課件沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。沉降系數(shù)是以時(shí)間表示的。蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子的S實(shí)際上時(shí)常在10的-13次方秒左右，故把沉降系數(shù)10的-13次方秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫(xiě)S，即10的-13方秒=1S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。沉降系數(shù)是以時(shí)離心方式離心運(yùn)動(dòng)是指物體有遠(yuǎn)離中心運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)離心機(jī)的類型分為水平離心、角離心（偏水平）和垂直離心三種。根據(jù)離心方式分為差速離心和密度梯度離心兩種。離心方式離心運(yùn)動(dòng)是指物體有遠(yuǎn)離中心運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)離心方式分差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉降差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。對(duì)于精細(xì)的分離，則是密度梯度離心效果更好。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種1、速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)胞器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。2、等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞。密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種速度沉降等密度沉降速度沉降等密度沉降三、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移細(xì)胞器轉(zhuǎn)移是將一個(gè)物種的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種細(xì)胞中的技術(shù)。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移類似細(xì)胞核移植技術(shù)。不同的是操作對(duì)象為細(xì)胞器，不是細(xì)胞核。最常見(jiàn)的是線粒體和葉綠體的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移方法有微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞吞胞飲等方式。三、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移細(xì)胞器轉(zhuǎn)移是將一個(gè)物種的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來(lái)源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉綠體）與一個(gè)特定的細(xì)胞核組合在一起得到的細(xì)胞稱為胞質(zhì)雜種。概念二：來(lái)自兩個(gè)原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的細(xì)胞，其中一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核消失后，兩個(gè)親代原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雜交得到的個(gè)體成為胞質(zhì)雜種。核心概念是細(xì)胞質(zhì)的雜交，不是細(xì)胞核，其中細(xì)胞質(zhì)中存在不同來(lái)源的細(xì)胞器，尤其是線粒體和葉綠體。四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來(lái)源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉細(xì)胞融合細(xì)胞融合(Cellfusion)：又稱體細(xì)胞雜交，是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的體細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞，使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)。細(xì)胞融合方法包含人工方法和無(wú)性方法1、人工方法：是指在外力使用誘導(dǎo)劑或促融劑、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、超聲波、重力、激光等因素的作用。2、無(wú)性方式：是區(qū)別于有性方式而言的，有自然條件下，生殖細(xì)胞卵子和精子相互接觸會(huì)發(fā)生細(xì)胞融合的現(xiàn)象。細(xì)胞融合細(xì)胞融合(Cellfusion)：又稱體細(xì)胞雜交，1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞；20世紀(jì)50年代：日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可以引起細(xì)胞的融合；1965年：英國(guó)的科學(xué)家海利斯成功得到了融合細(xì)胞；1964年：HAT（次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)）選擇培養(yǎng)基應(yīng)用于融合細(xì)胞的選擇；1974年：加拿大華裔科學(xué)家高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）能夠促使植物的原生質(zhì)體融合；1982年：出現(xiàn)了電融合技術(shù)；近20年：從細(xì)胞融合的理論和實(shí)踐兩個(gè)方面進(jìn)行了大量研究，細(xì)胞融合的方法不斷更新和完善，融合率逐步提高。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展史1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞；細(xì)胞融合技生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978幾種細(xì)胞融合成功的例子生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間葉——葉1972幾種細(xì)胞細(xì)胞融合的類型異核體：來(lái)自兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。同核體：基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。細(xì)胞融合包括對(duì)稱融合和不對(duì)稱融合。1、對(duì)稱融合：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。2、不對(duì)稱融合：其中一個(gè)細(xì)胞通過(guò)物理、化學(xué)或者生物的方法使該細(xì)胞的細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)失活后再與另一個(gè)完整的細(xì)胞進(jìn)行的融合。細(xì)胞融合的類型異核體：來(lái)自兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞融合成的融合細(xì)細(xì)胞融合的過(guò)程1、兩原生質(zhì)體或者細(xì)胞彼此靠近；2、質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋；3、胞質(zhì)滲透；4、細(xì)胞核融合。細(xì)胞融合的過(guò)程1、兩原生質(zhì)體或者細(xì)胞彼此靠近；細(xì)胞橋的形成過(guò)程細(xì)胞橋的形成過(guò)程植物細(xì)胞融合過(guò)程人造小鼠培育過(guò)程示意圖植物細(xì)胞融合過(guò)程人造小鼠培育過(guò)程示意圖細(xì)胞融合的意義改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)生產(chǎn)抗腫瘤疫苗生產(chǎn)單克隆抗體用于基因定位用于動(dòng)物育種有利于基礎(chǔ)理論研究細(xì)胞融合的意義改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)細(xì)胞融合基本原理1、細(xì)胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白細(xì)胞融合的關(guān)鍵是要脂雙層的接觸，就是要去除糖蛋白，露出無(wú)糖蛋白覆蓋的區(qū)域，使兩個(gè)細(xì)胞的脂雙層能緊密結(jié)合。細(xì)胞融合基本原理1、細(xì)胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白2、病毒促進(jìn)細(xì)胞融合很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，其原理大致如下：病毒的一邊黏接在一個(gè)細(xì)胞表面，病毒的另一邊黏接在另一個(gè)細(xì)胞表面，從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。仙臺(tái)病毒促進(jìn)細(xì)胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的兩種糖蛋白（HA、NA和F蛋白）可和細(xì)胞膜表面的糖蛋白發(fā)生作用，相互結(jié)合，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細(xì)胞表面之間產(chǎn)生一些微小的細(xì)胞質(zhì)橋。2、病毒促進(jìn)細(xì)胞融合3、化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞融合（聚乙二醇PEG）PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的兩種方式：PEG含有醚鍵、帶負(fù)電性可與細(xì)胞表面正的極性集團(tuán)相連，引起細(xì)胞膜表面的蛋白起作用，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開(kāi)質(zhì)膜，細(xì)胞融合。PEG和水之間的氫鍵相結(jié)合，使溶液中的自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生膜結(jié)構(gòu)的變化，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開(kāi)質(zhì)膜，細(xì)胞融合。3、化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞融合（聚乙二醇PEG）4、電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合低壓交流電場(chǎng)中，細(xì)胞聚集成串珠狀緊密排列，相互接觸的細(xì)胞膜之間會(huì)出現(xiàn)無(wú)蛋白顆粒的脂質(zhì)區(qū)，當(dāng)受到電擊時(shí)，這個(gè)區(qū)域就會(huì)被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通，發(fā)生細(xì)胞融合。細(xì)胞置于非常高的電場(chǎng)中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。4、電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合1、細(xì)胞種類和性質(zhì)細(xì)胞表面性質(zhì)細(xì)胞種類2、環(huán)境條件的影響溫度：

pH：最適為7.4-7.8

氧氣含量：耗氧量較大，一般大于20%3、離子強(qiáng)度及離子種類細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2＋，最適為0.1mol/L細(xì)胞融合的影響因素動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合的影響因素植物或微生物細(xì)胞融合1、PEG誘導(dǎo)融合的時(shí)間2、PEG純度3、融合密度一般為2x104－8x104個(gè)/ml4、融合液中加入少量的CaCI25、其他添加組份植物或微生物細(xì)胞融合互補(bǔ)作用：親本細(xì)胞的性狀同時(shí)在雜種細(xì)胞中表現(xiàn)。激活作用：親本細(xì)胞的不活動(dòng)基因在雜種細(xì)胞表達(dá)。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬細(xì)胞，與Hela細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞則可以合成兩種核酸。消失作用：親本細(xì)胞的性狀在雜種細(xì)胞中消失。如金黃倉(cāng)鼠的黑色素瘤細(xì)胞可產(chǎn)生黑色素，小鼠的成纖維細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素，它們的雜種細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素。同時(shí)具有激活和消失作用如小鼠的胸腺細(xì)胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎發(fā)育早期t12基因表達(dá)，h2基因不表達(dá)，在成年小鼠中h2基因表達(dá)，t12基因不表達(dá)，而在成年小鼠的胸腺細(xì)胞與小鼠胚胎性瘤細(xì)胞融合的雜種細(xì)胞中，h2基因不表達(dá)，卻激活了t12基因，使其表達(dá)。融合細(xì)胞特性的表現(xiàn)形式互補(bǔ)作用：親本細(xì)胞的性狀同時(shí)在雜種細(xì)胞中表現(xiàn)。融合細(xì)胞特性的融合細(xì)胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選擇法；一類是根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)記形狀的機(jī)械選擇法?？顾幮院Y選系統(tǒng)如親本A對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡那霉素不敏感，親本B對(duì)氨芐青霉素不敏感，對(duì)卡那霉素敏感，融合后的細(xì)胞對(duì)兩種抗生素都不敏感。營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)親本A為色氨酸缺陷型，親本B為蘇氨酸缺陷型，融合細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)。溫度敏感突變型融合細(xì)胞篩選親本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生長(zhǎng)，親本B為高溫敏感突變型，不具備卡那霉素抗性，融合細(xì)胞能在高溫和卡那霉素抗性平板生長(zhǎng)。融合細(xì)胞的篩選融合細(xì)胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選擇物理特性篩選利用細(xì)胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在顯微鏡下用微管將融合細(xì)胞吸取挑選出來(lái)，也可以用離心的方式。熒光表記法

利用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素和發(fā)紅色熒光的堿性芯香紅熒光素分別標(biāo)記兩個(gè)親本細(xì)胞，融合后的細(xì)胞內(nèi)存在兩種熒光標(biāo)記物，利用流式細(xì)胞儀可進(jìn)行分選。物理特性篩選細(xì)胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）：去除細(xì)胞壁后裸露的球型細(xì)胞。原生質(zhì)體主要是植物細(xì)胞，植物細(xì)胞壁主要成份為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)。原生質(zhì)體雖然沒(méi)有細(xì)胞壁，但仍能進(jìn)行基本的生命活動(dòng)，在離體培養(yǎng)下可再生細(xì)胞壁。細(xì)胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)：1、吸收能力增強(qiáng)：易于攝取外來(lái)遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細(xì)胞壁再生并能進(jìn)行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力；3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細(xì)胞。4、分泌能力提高：去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，使細(xì)胞膜的透過(guò)性增強(qiáng)，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。5、穩(wěn)定性較差：失去了細(xì)胞壁的保護(hù)作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響。植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)：原生質(zhì)體用途信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞壁合成機(jī)理膜的結(jié)構(gòu)與功能核質(zhì)關(guān)系雜交或自交不親和的機(jī)理細(xì)胞間的相互作用植物激素的作用機(jī)理融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種分離各種細(xì)胞器引入各種細(xì)胞器導(dǎo)入外源基因誘發(fā)突變體原生質(zhì)體用途信息傳遞、能量轉(zhuǎn)換融合產(chǎn)生體細(xì)胞雜種原生質(zhì)體的制備*植物葉片取材容易比較容易用酶解法分離*植物根尖組織可由各種植物的種子萌發(fā)后取得*植物花粉產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體*愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞壁容易解離材料來(lái)源原生質(zhì)體的制備*植物葉片材料來(lái)源原生質(zhì)體制備的前提是去除細(xì)胞壁，通常使用機(jī)械法和生物酶法。機(jī)械法：細(xì)胞放入高滲糖溶液中，質(zhì)壁分離，剪碎組織，在這個(gè)過(guò)程中，有些質(zhì)壁分離的細(xì)胞只被切去了細(xì)胞壁，從而釋放出完整的原生質(zhì)體。產(chǎn)量低；方法繁瑣費(fèi)力；局限性大。分生組織和其他液泡化程度不高的細(xì)胞中分離原生質(zhì)體時(shí)不能用此法。原生質(zhì)體制備的前提是去除細(xì)胞壁，通常使用機(jī)械法和生物酶法。生物酶法：利用酶處理細(xì)胞壁，從而釋放出原生質(zhì)體。條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、收率高。纖維素酶類（Cellulase）：從綠色木霉中提取。果膠酶類（Pectolyase）：也叫離析酶，從根霉、黑曲霉中提取。半纖維素酶（Hemicellulase）：從黑曲霉中提取。常用于從愈傷組織中分離原生質(zhì)體。崩潰酶蝸牛酶生物酶法：利用酶處理細(xì)胞壁，從而釋放出原生質(zhì)體。條件溫和、原第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合課件過(guò)濾、離心加果膠酶和纖維素酶原生質(zhì)體分離過(guò)程（以葉片為例）過(guò)濾、離心加果膠酶原生質(zhì)體分離過(guò)程（以葉片為例）原生質(zhì)體純化的方法：去除破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞器及其他碎片等雜質(zhì)。(1)沉降法：利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過(guò)濾（44-169μm的篩網(wǎng)），然后低速離心（900-4500r/min)，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。比較簡(jiǎn)單，但不易除盡一些完整的細(xì)胞，或引起原生質(zhì)的破碎。(2)漂浮法：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面?？梢缘玫捷^為純凈、完整的原生質(zhì)體，但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少。原生質(zhì)體純化的方法：500mmol/L蔗糖140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇+原生質(zhì)體(3)界面法：采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中。可以收到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免收集過(guò)程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。500mmol/L蔗糖140mmol/L蔗糖+360mmo原生質(zhì)體的培養(yǎng)①液體培養(yǎng)液體淺層培養(yǎng)②固體平板法③固液雙層培養(yǎng)法

瓊脂糖珠培養(yǎng)原生質(zhì)體的培養(yǎng)原生質(zhì)體活力檢測(cè)染色法

FDA法：FDA（二乙酸熒光素）能穿越細(xì)胞質(zhì)膜，被活細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解，在熒光顯微鏡下發(fā)熒光（熒光素）。伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過(guò)質(zhì)膜，但質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使細(xì)胞被染色。胞質(zhì)環(huán)流法：是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生質(zhì)體活力；滲透壓變化法：活原生質(zhì)體會(huì)隨著外界滲透壓的變化體積變化氧電極法：活原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無(wú)光呼吸耗氧原生質(zhì)體活力檢測(cè)染色法第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院細(xì)胞重組與細(xì)胞融合細(xì)胞重組：從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組份，在體外進(jìn)行重新裝配成為具有生物活性的細(xì)胞的一種技術(shù)。細(xì)胞融合：人工方法使2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞合并形成1個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞重組與細(xì)胞融合細(xì)胞重組：從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組份，核體與胞質(zhì)體核體：與細(xì)胞質(zhì)分離后得到的帶有少量細(xì)胞質(zhì)并包有質(zhì)膜的細(xì)胞核，也成為小型細(xì)胞。核體能夠重生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長(zhǎng)分裂。胞質(zhì)體：除去細(xì)胞核后由質(zhì)膜包裹的無(wú)核細(xì)胞。細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)胞排核反應(yīng)，此時(shí)通過(guò)離心的方法可以將核體與胞質(zhì)體分離。核體與胞質(zhì)體微細(xì)胞微細(xì)胞：又稱微核體，含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。秋水仙素和長(zhǎng)春新堿等有絲分離阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期染色體產(chǎn)生發(fā)散運(yùn)動(dòng)，發(fā)散開(kāi)的染色體各自裝配出自己的核膜，形成微細(xì)胞。秋水仙胺細(xì)胞松弛素B細(xì)胞松弛素B離心微細(xì)胞秋水仙胺細(xì)胞松弛素B細(xì)胞松弛素B離心胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的重組形成胞質(zhì)雜種；微細(xì)胞與完整細(xì)胞的重組形成微細(xì)胞核異體；胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞。細(xì)胞重組的方式胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的重組形成胞質(zhì)雜種；細(xì)胞重組的方式細(xì)胞重組技術(shù)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)建不同類型的雜種細(xì)胞提供可能；細(xì)胞重組技術(shù)可以人為的將染色體或者基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使重組細(xì)胞產(chǎn)生新的性狀和新的特性。細(xì)胞重組的意義細(xì)胞重組技術(shù)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)工程：是研究真核細(xì)胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細(xì)胞質(zhì)工程是進(jìn)行細(xì)胞重組的重要基礎(chǔ)。細(xì)胞質(zhì)工程涉及的技術(shù)有：1、細(xì)胞破碎2、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離3、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移4、胞質(zhì)雜種細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)工程：是研究真核細(xì)胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細(xì)胞器、一、細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)胞破碎方法包含：1、超聲波破碎法2、反復(fù)凍融法3、高速組織搗碎法4、化學(xué)裂解法5、生物酶解法一、細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液，由發(fā)生器和換能器組成。反復(fù)凍融法將細(xì)胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。超聲波破碎法高速組織搗碎法借助高速組織搗碎機(jī)使細(xì)胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片打碎?；瘜W(xué)裂解法通過(guò)化學(xué)藥品改變細(xì)胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法利用溶解細(xì)胞壁的酶處理細(xì)胞，破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含組分釋放。高速組織搗碎法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離細(xì)胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不同，因此，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法將細(xì)胞內(nèi)各種組份分級(jí)分離出來(lái)。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離過(guò)程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步。細(xì)胞勻漿要在低溫條件、等滲緩沖液（等滲勻漿介質(zhì)，如0.25mol/L的蔗糖）中進(jìn)行。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離方法包含：1、差速離心法2、密度梯度分離法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離細(xì)胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合課件沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。沉降系數(shù)是以時(shí)間表示的。蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子的S實(shí)際上時(shí)常在10的-13次方秒左右，故把沉降系數(shù)10的-13次方秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫(xiě)S，即10的-13方秒=1S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。沉降系數(shù)是以時(shí)離心方式離心運(yùn)動(dòng)是指物體有遠(yuǎn)離中心運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)離心機(jī)的類型分為水平離心、角離心（偏水平）和垂直離心三種。根據(jù)離心方式分為差速離心和密度梯度離心兩種。離心方式離心運(yùn)動(dòng)是指物體有遠(yuǎn)離中心運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)離心方式分差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉降差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。對(duì)于精細(xì)的分離，則是密度梯度離心效果更好。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種1、速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)胞器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。2、等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞。密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種速度沉降等密度沉降速度沉降等密度沉降三、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移細(xì)胞器轉(zhuǎn)移是將一個(gè)物種的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種細(xì)胞中的技術(shù)。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移類似細(xì)胞核移植技術(shù)。不同的是操作對(duì)象為細(xì)胞器，不是細(xì)胞核。最常見(jiàn)的是線粒體和葉綠體的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移方法有微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞吞胞飲等方式。三、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移細(xì)胞器轉(zhuǎn)移是將一個(gè)物種的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來(lái)源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉綠體）與一個(gè)特定的細(xì)胞核組合在一起得到的細(xì)胞稱為胞質(zhì)雜種。概念二：來(lái)自兩個(gè)原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的細(xì)胞，其中一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核消失后，兩個(gè)親代原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雜交得到的個(gè)體成為胞質(zhì)雜種。核心概念是細(xì)胞質(zhì)的雜交，不是細(xì)胞核，其中細(xì)胞質(zhì)中存在不同來(lái)源的細(xì)胞器，尤其是線粒體和葉綠體。四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來(lái)源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉細(xì)胞融合細(xì)胞融合(Cellfusion)：又稱體細(xì)胞雜交，是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的體細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞，使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)。細(xì)胞融合方法包含人工方法和無(wú)性方法1、人工方法：是指在外力使用誘導(dǎo)劑或促融劑、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、超聲波、重力、激光等因素的作用。2、無(wú)性方式：是區(qū)別于有性方式而言的，有自然條件下，生殖細(xì)胞卵子和精子相互接觸會(huì)發(fā)生細(xì)胞融合的現(xiàn)象。細(xì)胞融合細(xì)胞融合(Cellfusion)：又稱體細(xì)胞雜交，1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞；20世紀(jì)50年代：日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可以引起細(xì)胞的融合；1965年：英國(guó)的科學(xué)家海利斯成功得到了融合細(xì)胞；1964年：HAT（次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)）選擇培養(yǎng)基應(yīng)用于融合細(xì)胞的選擇；1974年：加拿大華裔科學(xué)家高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）能夠促使植物的原生質(zhì)體融合；1982年：出現(xiàn)了電融合技術(shù)；近20年：從細(xì)胞融合的理論和實(shí)踐兩個(gè)方面進(jìn)行了大量研究，細(xì)胞融合的方法不斷更新和完善，融合率逐步提高。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展史1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞；細(xì)胞融合技生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978幾種細(xì)胞融合成功的例子生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間葉——葉1972幾種細(xì)胞細(xì)胞融合的類型異核體：來(lái)自兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。同核體：基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。細(xì)胞融合包括對(duì)稱融合和不對(duì)稱融合。1、對(duì)稱融合：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。2、不對(duì)稱融合：其中一個(gè)細(xì)胞通過(guò)物理、化學(xué)或者生物的方法使該細(xì)胞的細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)失活后再與另一個(gè)完整的細(xì)胞進(jìn)行的融合。細(xì)胞融合的類型異核體：來(lái)自兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞融合成的融合細(xì)細(xì)胞融合的過(guò)程1、兩原生質(zhì)體或者細(xì)胞彼此靠近；2、質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋；3、胞質(zhì)滲透；4、細(xì)胞核融合。細(xì)胞融合的過(guò)程1、兩原生質(zhì)體或者細(xì)胞彼此靠近；細(xì)胞橋的形成過(guò)程細(xì)胞橋的形成過(guò)程植物細(xì)胞融合過(guò)程人造小鼠培育過(guò)程示意圖植物細(xì)胞融合過(guò)程人造小鼠培育過(guò)程示意圖細(xì)胞融合的意義改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)生產(chǎn)抗腫瘤疫苗生產(chǎn)單克隆抗體用于基因定位用于動(dòng)物育種有利于基礎(chǔ)理論研究細(xì)胞融合的意義改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)細(xì)胞融合基本原理1、細(xì)胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白細(xì)胞融合的關(guān)鍵是要脂雙層的接觸，就是要去除糖蛋白，露出無(wú)糖蛋白覆蓋的區(qū)域，使兩個(gè)細(xì)胞的脂雙層能緊密結(jié)合。細(xì)胞融合基本原理1、細(xì)胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白2、病毒促進(jìn)細(xì)胞融合很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，其原理大致如下：病毒的一邊黏接在一個(gè)細(xì)胞表面，病毒的另一邊黏接在另一個(gè)細(xì)胞表面，從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。仙臺(tái)病毒促進(jìn)細(xì)胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的兩種糖蛋白（HA、NA和F蛋白）可和細(xì)胞膜表面的糖蛋白發(fā)生作用，相互結(jié)合，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細(xì)胞表面之間產(chǎn)生一些微小的細(xì)胞質(zhì)橋。2、病毒促進(jìn)細(xì)胞融合3、化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞融合（聚乙二醇PEG）PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的兩種方式：PEG含有醚鍵、帶負(fù)電性可與細(xì)胞表面正的極性集團(tuán)相連，引起細(xì)胞膜表面的蛋白起作用，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開(kāi)質(zhì)膜，細(xì)胞融合。PEG和水之間的氫鍵相結(jié)合，使溶液中的自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生膜結(jié)構(gòu)的變化，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開(kāi)質(zhì)膜，細(xì)胞融合。3、化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞融合（聚乙二醇PEG）4、電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合低壓交流電場(chǎng)中，細(xì)胞聚集成串珠狀緊密排列，相互接觸的細(xì)胞膜之間會(huì)出現(xiàn)無(wú)蛋白顆粒的脂質(zhì)區(qū)，當(dāng)受到電擊時(shí)，這個(gè)區(qū)域就會(huì)被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通，發(fā)生細(xì)胞融合。細(xì)胞置于非常高的電場(chǎng)中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。4、電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合1、細(xì)胞種類和性質(zhì)細(xì)胞表面性質(zhì)細(xì)胞種類2、環(huán)境條件的影響溫度：

pH：最適為7.4-7.8

氧氣含量：耗氧量較大，一般大于20%3、離子強(qiáng)度及離子種類細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2＋，最適為0.1mol/L細(xì)胞融合的影響因素動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合的影響因素植物或微生物細(xì)胞融合1、PEG誘導(dǎo)融合的時(shí)間2、PEG純度3、融合密度一般為2x104－8x104個(gè)/ml4、融合液中加入少量的CaCI25、其他添加組份植物或微生物細(xì)胞融合互補(bǔ)作用：親本細(xì)胞的性狀同時(shí)在雜種細(xì)胞中表現(xiàn)。激活作用：親本細(xì)胞的不活動(dòng)基因在雜種細(xì)胞表達(dá)。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬細(xì)胞，與Hela細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞則可以合成兩種核酸。消失作用：親本細(xì)胞的性狀在雜種細(xì)胞中消失。如金黃倉(cāng)鼠的黑色素瘤細(xì)胞可產(chǎn)生黑色素，小鼠的成纖維細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素，它們的雜種細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素。同時(shí)具有激活和消失作用如小鼠的胸腺細(xì)胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎發(fā)育早期t12基因表達(dá)，h2基因不表達(dá)，在成年小鼠中h2基因表達(dá)，t12基因不表達(dá)，而在成年小鼠的胸腺細(xì)胞與小鼠胚胎性瘤細(xì)胞融合的雜種細(xì)胞中，h2基因不表達(dá)，卻激活了t12基因，使其表達(dá)。融合細(xì)胞特性的表現(xiàn)形式互補(bǔ)作用：親本細(xì)胞的性狀同時(shí)在雜種細(xì)胞中表現(xiàn)。融合細(xì)胞特性的融合細(xì)胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選擇法；一類是根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)記形狀的機(jī)械選擇法?？顾幮院Y選系統(tǒng)如親本A對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡那霉素不敏感，親本B對(duì)氨芐青霉素不敏感，對(duì)卡那霉素敏感，融合后的細(xì)胞對(duì)兩種抗生素都不敏感。營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)親本A為色氨酸缺陷型，親本B為蘇氨酸缺陷型，融合細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)。溫度敏感突變型融合細(xì)胞篩選親本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生長(zhǎng)，親本B為高溫敏感突變型，不具備卡那霉素抗性，融合細(xì)胞能在高溫和卡那霉素抗性平板生長(zhǎng)。融合細(xì)胞的篩選融合細(xì)胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選擇物理特性篩選利用細(xì)胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在顯微鏡下用微管將融合細(xì)胞吸取挑選出來(lái)，也可以用離心的方式。熒光表記法

利用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素和發(fā)紅色熒光的堿性芯香紅熒光素分別標(biāo)記兩個(gè)親本細(xì)胞，融合后的細(xì)胞內(nèi)存在兩種熒光標(biāo)記物，利用流式細(xì)胞儀可進(jìn)行分選。物理特性篩選細(xì)胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）：去除細(xì)胞壁后裸露的球型細(xì)胞。原生質(zhì)體主要是植物細(xì)胞，植物細(xì)胞壁主要成份為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)。原生質(zhì)體雖然沒(méi)有細(xì)胞壁，但仍能進(jìn)行基本的生命活動(dòng)，在離體培養(yǎng)下可再生細(xì)胞壁。細(xì)胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)：1、吸收能力增強(qiáng)：易于攝取外來(lái)遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能