綠色熒光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物學(xué)研究中 的應(yīng)用課件

綠色熒光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物學(xué)研究中

的應(yīng)用

生物發(fā)光現(xiàn)象,在無脊椎動(dòng)物中很普遍。它是生物能量的一種轉(zhuǎn)換方式[1,2]。在水母(Jellyfish)中,當(dāng)能量從Ca++活化的水母蛋白(Aequorin)轉(zhuǎn)移到綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,簡(jiǎn)稱GFP)上以后，它即發(fā)出綠色熒光?；铙wGFP與純化的GFP具有相同光譜特性,即吸收藍(lán)光,放射綠光?？梢杂米贤鉄?、熒光顯微鏡或熒光活化流體分光光度計(jì)進(jìn)行活體檢測(cè)。由于GFP穩(wěn)定、靈敏度高、無生物毒性、熒光反應(yīng)不需要任何外源反應(yīng)底物及表達(dá)無物種或細(xì)胞組織的專一性,因此它是一種獨(dú)特的報(bào)告蛋白(Reporterprotein),可廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化,以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域。90年代后,有關(guān)GFP及其利用的研究進(jìn)展較快，已引起分子生物學(xué)家極大的興趣與關(guān)注。一GFP的結(jié)構(gòu)、特性與功能1GFP的結(jié)構(gòu)PrasherDC首先克隆了水母Jellyfish(AequoreavictoriaGFP)的cDNA[6],GFP編碼的238個(gè)氨基酸的多肽單體，推導(dǎo)分子量Mr=26888，與先前用變性電泳測(cè)得的天然GFP分子量（30KDa）接近。根據(jù)DNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP分子才會(huì)產(chǎn)生生物熒光,但與熒光的產(chǎn)生直接有關(guān)的是GFP分子中一小段被稱為色基(Chromophore)的部位（圖2。在GFP的初級(jí)氨基酸序列上,第65～67個(gè)氨基酸(SerˉTyrˉGly）ˉˉˉˉ形成環(huán)狀六肽三體,以共價(jià)形式與GFP蛋白肽鍵骨架相連。色基形成的機(jī)理目前尚不清楚,但在有分子氧存在的條件下,酪氨酸氧化成脫氫酪氨酸,并環(huán)化形成六肽,這可能是形成色基的必然過程。Shimomura最先推導(dǎo)了水母GFP色基結(jié)構(gòu)，后來Ward等進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證與修改。GFP的cDNA克隆序列分析表明，在2.6kb范圍內(nèi)至少分布有3個(gè)啟動(dòng)子，組成色基的SerˉTyrˉGly三體就位于第二個(gè)內(nèi)含子3’端3GFP的穩(wěn)定性

GFP熒光極其穩(wěn)定,在熒光顯微鏡強(qiáng)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強(qiáng)[19]。特別在450~490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定,但在340~390nm或395~440nm范圍內(nèi),仍會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象。GFP在不同物種中穩(wěn)定性不同,在果蠅和斑紋魚(Zebrafish)中極穩(wěn)定;在大腸桿菌中會(huì)有光漂白;在線蟲中10mM的NaN3將加速光漂白。GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光,強(qiáng)還原劑如5mMNa2S2O4或2mMFeSO4能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復(fù)。而一些弱還原劑,如2%巰基乙醇、10mMDDT、10mM還原谷胱甘肽、10mM半胱氨酸等并不影響GFP熒光。中度氧化劑對(duì)GFP熒光影響也不大,如生物材料的固定、脫水劑戊二酸或甲醛等,但GFP對(duì)某些封片指甲油特別敏感,苯氧丙烷對(duì)GFP熒光也有影響。強(qiáng)氧化劑如1%H2O2,或硫氫基試劑如1mMDTNB會(huì)造成GFP不可逆性破壞[20]。大多數(shù)中等濃度的有機(jī)試劑不減弱GFP熒光,但其最大吸收峰值會(huì)改變[21]。在高蛋白、高鹽條件下,GFP通過疏水反應(yīng)形成二聚體,使470nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易從細(xì)胞中分離并結(jié)晶[22]。在離體狀態(tài)下,GFP蛋白對(duì)熱(70℃)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通蛋白酶(鏈霉蛋白酶Pronase除外)有較強(qiáng)抗性[23]。GFP熒光在pH值為7~12時(shí)穩(wěn)定,在pH值為5.5~7.0時(shí)開始受影響[24]。在納克級(jí)水平,SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠中仍能觀察到GFP熒光。在高溫、極端pH、或胍基氯化物條件下,GFP會(huì)變性,熒光消失。一旦復(fù)性,熒光會(huì)部分恢復(fù)[25],但可能需要某些硫醇類化合物的作用[26]。GFP在各種生物活體條件下表現(xiàn)穩(wěn)定。例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)在生物體內(nèi)很穩(wěn)定,用35S-甲硫氨酸分別標(biāo)記CAT和GFP,并轉(zhuǎn)染玉米葉肉原生質(zhì)體,用放線菌酮處理原生質(zhì)體,通過CAT檢測(cè),發(fā)現(xiàn)5~10μg/ml放線菌酮可完全抑制CAT在玉米原生質(zhì)體中的蛋白合成,但通過GFP觀察,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,仍未發(fā)現(xiàn)GFP熒光有明顯減弱,僅有部分GFP被放線菌酮降解。說明GFP在植物活體細(xì)胞中比CAT還要穩(wěn)定[27]。此外,盡管GFP的消光系數(shù)較低,但和熒光素一樣,額定含量可高達(dá)80%。在熒光顯微鏡下,GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測(cè)定與分析。但因?yàn)镚FP不是酶,熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP是迄今為止唯一一種活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的。二GFP在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.1GFP作為報(bào)告基因用于轉(zhuǎn)基因研究自PrasherDC從水母(A.victoria)中克隆了GFP的cDNA后,GFP能在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體相繼被構(gòu)建成功。ChalfieM構(gòu)建了GFP大腸桿菌表達(dá)載體,GFP基因在T7啟動(dòng)子控制下很容易在大腸桿菌中高效表達(dá)。從轉(zhuǎn)染的大腸桿菌中分離的GFP蛋白與水母的天然GFP離體光譜特性無差異。利用維管蛋白(β-tubulin)基因mec-7啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染線蟲(Caenorhabditiselegans),在幼蟲的4種胚性起源觸覺受體神經(jīng)元細(xì)胞中,觀察到很強(qiáng)、很穩(wěn)定的GFP熒光,包括部分2齡幼蟲、所有4齡幼蟲和絕大多數(shù)幼小成蟲。據(jù)報(bào)道,GFP基因在酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蠅(Drosophilamelanogaster)以及多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系、人體胚性腎細(xì)胞系、猿猴Cos-1細(xì)胞系以及鼠NIH3T3細(xì)胞系等)中表達(dá),都相繼成功[20,29,30,31,32]。GFP在高等植物中的利用較晚,表達(dá)成功的例子還不多。SheenJ等報(bào)道,通過電擊法(Electroporation)轉(zhuǎn)染玉米葉肉原生質(zhì)體,有50%原生質(zhì)體觀察到GFP熒光,集中在細(xì)胞質(zhì)或核周圍部。紫外光下液泡顯藍(lán)色熒光,藍(lán)光下葉綠體顯紅色熒光,出現(xiàn)黃色熒光是葉綠體紅色熒光與GFP綠色熒光的重疊效果。HuW也報(bào)道,用電擊法和PEG法同時(shí)轉(zhuǎn)化玉米和擬南芥菜(Arabidopsis)原生質(zhì)體,GFP在玉米原生質(zhì)體中表達(dá),但PEG介導(dǎo)比電擊法轉(zhuǎn)化效率高,而擬南芥菜原生質(zhì)體中未觀察到GFP表達(dá)[33]。不過SheenJ等利用基因槍(Microprojectilebombardment)轟擊擬南芥菜完整葉片和根組織,觀察到活體GFP熒光。NiedzRP等用電擊法轉(zhuǎn)化甜橙(Citrussinensis)原生質(zhì)體,450~490nm藍(lán)光下觀察到20%~60%原生質(zhì)體發(fā)生較強(qiáng)綠色熒光[34]。此外,也有GFP在菸草、水稻中表達(dá)的報(bào)道。GFP在多種原核和真核生物細(xì)胞中表達(dá),表明GFP色基形成的翻譯后修飾過程并非需要原有水母(A.victoria)細(xì)胞中任何其它成份或共因子。亦表明GFP作為報(bào)告基因,其表達(dá)不受生物類型、基因型或細(xì)胞組織類型的限制,具有廣泛的利用前景。2.2GFP作為報(bào)告蛋白用于基因表達(dá)的調(diào)控效果研究Clontech公司構(gòu)建了一種叫啟動(dòng)子報(bào)告載體(Promoterreportervector)即沒有啟動(dòng)子的GFP質(zhì)粒,專門用來測(cè)試各種啟動(dòng)子對(duì)GFP表達(dá)的效率,以及某些增強(qiáng)子對(duì)GFP表達(dá)的調(diào)控效果。發(fā)現(xiàn)用玉米C4PPDK基因5′端的非翻譯片段(5′VTR)與花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子連接,GFP在玉米原生質(zhì)體中的表達(dá)效率比對(duì)照質(zhì)粒(只有35S啟動(dòng)子)提高近15倍,因?yàn)?′VTR片段中含轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。用擬南芥菜熱體克(Heat-shock)基因啟動(dòng)子構(gòu)建GFP表達(dá)載體,用以轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。發(fā)現(xiàn)42℃熱激處理中50%原生質(zhì)體表達(dá)GFP熒光;37℃處理的熒光較弱;而常溫下培養(yǎng),則完全觀察不到原生質(zhì)體中的GFP熒光。在高等植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)調(diào)控研究中,已有很多報(bào)告蛋白被應(yīng)用,包括LacZ(β-galactosidase)[35]、CAT(Chloramphenicolacethytransferase)[36]、Luc(熒光蟲Luciferase)[37,38]和GUS(β-glucuronidase)[39]等。但這些報(bào)告蛋白都是酶,其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)都需要進(jìn)行細(xì)胞固定、組織切片或蛋白提取等破壞性處理,很難用于活體觀察和檢測(cè)。GFP作為一種活體報(bào)告蛋白[40],用于研究基因表達(dá)的調(diào)控,明顯具有其它報(bào)告蛋白不可替代的優(yōu)點(diǎn)2.4GFP報(bào)告蛋白用于細(xì)胞活體分離與純化

利用細(xì)胞表面標(biāo)記,通過流體細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(FACS),可以分離與純化特殊類型細(xì)胞,對(duì)分析cDNA文庫、研究基因的細(xì)胞發(fā)育或組織專一性表達(dá)十分重要[51,52]。利用GFP融合蛋白為細(xì)胞表面活體熒光標(biāo)記,通過篩選已經(jīng)獲得GFP表達(dá)的大腸桿菌、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì)胞特殊類型。SheenJ等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體的流體參數(shù)分析中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染15~18小時(shí)后,對(duì)照中只有一類細(xì)胞叢,表現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光和微弱的綠色熒光,并且細(xì)胞間熒光強(qiáng)度相當(dāng)一致,沒有明顯差異。而GFP轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢,第一類與對(duì)照相似,呈現(xiàn)紅色熒光,約占細(xì)胞總數(shù)66.3%;第二類細(xì)胞叢呈現(xiàn)綠色熒光,熒光強(qiáng)度是對(duì)照的74倍。因此,用流式細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(EpicsElite,ConlterElectronics,MiamiFL,USA)很容易將兩類細(xì)胞分離開來。原生質(zhì)體可