發(fā)酵車間課程設(shè)計(jì)

發(fā)酵車間課程設(shè)計(jì)10生物技術(shù)第二組主講人:課題

大腸桿菌的高密度發(fā)酵要求50L發(fā)酵罐大綱大腸桿菌介紹發(fā)酵介紹高密度發(fā)酵介紹實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及條件的確定發(fā)酵流程與控制發(fā)酵注意事項(xiàng)大腸桿菌介紹腸埃希氏菌(E.coli)通常稱為大腸桿菌，是Escheric在1885年發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌是細(xì)菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡(jiǎn)單的細(xì)胞器，沒(méi)有細(xì)胞核有擬核；細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運(yùn)載體大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用：大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系在培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)無(wú)需添加生長(zhǎng)因子，向培養(yǎng)基中加入伊紅美藍(lán)遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在在這里必須指出的是，處于生物安全考慮，生物工程用的菌株是在不斷篩選后被挑選出的菌株。這些菌株由于失去的細(xì)胞壁的重要組分，所以在自然條件下已無(wú)法生長(zhǎng)。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。這樣，即便由于操作不慎導(dǎo)致活菌從實(shí)驗(yàn)室流出，也不易導(dǎo)致生化危機(jī)。發(fā)酵介紹有機(jī)物被生物體氧化降解成氧化產(chǎn)物并釋放能量的過(guò)程統(tǒng)稱為生物氧化.微生物生理學(xué)把生物氧化區(qū)分為呼吸和發(fā)酵，呼吸又可進(jìn)一步區(qū)分為有氧呼吸和無(wú)氧呼吸。因此，發(fā)酵是生物氧化的一種方式。工業(yè)生產(chǎn)上籠統(tǒng)地把一切依靠微生物的生命活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)的工業(yè)生產(chǎn)均稱為“發(fā)酵”借用理工大學(xué)的發(fā)酵工程課件來(lái)對(duì)發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行直觀的認(rèn)識(shí)發(fā)酵罐發(fā)酵的特點(diǎn)發(fā)酵過(guò)程一般來(lái)說(shuō)都是在常溫常壓下進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)安全，要求條件也比較簡(jiǎn)單。發(fā)酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農(nóng)副產(chǎn)品為主，只要加入少量的有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源就可進(jìn)行反應(yīng)。發(fā)酵過(guò)程是通過(guò)生物體的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式來(lái)完成的，反應(yīng)的專一性強(qiáng)，因而可以得到較為單—的代謝產(chǎn)物三種發(fā)酵操作方式介紹分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵分批補(bǔ)料發(fā)酵分批發(fā)酵分批發(fā)酵又稱為分批培養(yǎng)，是指在一個(gè)密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，使微生物生長(zhǎng)繁殖，在特定的條件下只完成一個(gè)生長(zhǎng)周期的微生物培養(yǎng)方法。連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過(guò)程。連續(xù)發(fā)酵可分為單罐連續(xù)發(fā)酵和多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵等方式。分批補(bǔ)料發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定的發(fā)酵過(guò)程。連續(xù)發(fā)酵可分為單罐連續(xù)發(fā)酵和多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵等方式。高密度發(fā)酵介紹高細(xì)胞密度發(fā)酵(highcelldensitycultivation，HCDC)是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，獲得最多的細(xì)胞量，由此更多地或更高效地獲得目的產(chǎn)物。即利用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)。通常認(rèn)為菌體密度超過(guò)50g(DCW)/L即為高密度發(fā)酵。根據(jù)Riesenbere計(jì)算，理論上大腸桿菌發(fā)達(dá)到酵所能的最高菌體密度為400g(DCW/L)，考慮到實(shí)際情況中的種種條件限制，Markel等認(rèn)為最高的菌體密度為200g(DCW/L)，此時(shí)發(fā)酵液的25%充滿了長(zhǎng)3μm，寬1μm的大腸桿菌，發(fā)酵液粘度很高，幾乎喪失流動(dòng)性。影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的因素培養(yǎng)基溶氧濃度PH溫度代謝副產(chǎn)物培養(yǎng)基高密度發(fā)酵對(duì)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)源的種類和含量比要求較高，如碳源和氮源的比例偏小，會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)旺盛，造成菌體提前衰老自溶；比例偏大，則菌體繁殖數(shù)量少，細(xì)胞代謝不平衡，不利于產(chǎn)物積累。葡萄糖是高密度發(fā)酵中常用的碳源，但濃度過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生乙酸，因此要保證較低的葡萄糖濃度。氮源、微量元素和無(wú)機(jī)鹽對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和外源蛋白的表達(dá)也有很大影響。溶氧濃度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體密度迅速增加，溶氧濃度隨之下降，細(xì)胞的生長(zhǎng)減慢。特別是高密度發(fā)酵的后期，由于菌體密度的擴(kuò)增，耗氧量極大，發(fā)酵罐各項(xiàng)物理參數(shù)均不能滿足對(duì)氧的供給，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)極為緩慢，外源蛋白的表達(dá)量也較差。在發(fā)酵過(guò)程中保證適宜的溶氧濃度，必須確定發(fā)酵罐的通氣量和攪拌速度。PH大腸桿菌利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，特別是大量的乙酸和二氧化碳，使pH降低，必須調(diào)節(jié)pH在適宜的范圍。溫度培養(yǎng)溫度在適宜的范圍，對(duì)于溫控誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和持續(xù)時(shí)間對(duì)于重組蛋白的產(chǎn)量由很大影響。代謝副產(chǎn)物乙酸

二氧化碳葡萄糖的濃度超過(guò)某一閾值，會(huì)產(chǎn)生乙酸，或者比生長(zhǎng)速率過(guò)高，供氧不足，也會(huì)產(chǎn)生乙酸。為降低培養(yǎng)基中代謝副產(chǎn)物的積累，可采用流加補(bǔ)料的措施，或保持適當(dāng)?shù)谋壬L(zhǎng)速率，或在培養(yǎng)基中添加某些氨基酸。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及條件的確定首先了解幾種測(cè)定方法還原糖的測(cè)定方法氨基酸的測(cè)定方法大腸桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定還原糖的測(cè)定

還原糖是具有羰基（＞C＝O）的糖，能將其他物質(zhì)還原而其本身被氧化。(1)還原糖在堿性條件下加熱，在酒石酸鉀鈉存在的情況下，可以定量地將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子，即產(chǎn)生磚紅色的氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應(yīng)如下：(2)氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型的鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，生成一種藍(lán)色復(fù)合物即砷鉬藍(lán)，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖含量（即被還原的Cu2O量）成正比，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后用做標(biāo)準(zhǔn)，就可測(cè)得樣品中還原糖含量。氨基酸含量測(cè)定以甲醛滴定法測(cè)定氨基酸含量為例進(jìn)行簡(jiǎn)單說(shuō)明水溶液中的氨基酸為兼性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。甲醛可與氨基酸上的—N+H3結(jié)合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羥甲基衍生物，使N+H3上的H+游離出來(lái)，這樣就可以用堿滴定N+H3放出H+，測(cè)出氨基氮，從而計(jì)算氨基酸的含量。若樣品中只含有單一的已知氨基酸，則可由此法滴定的結(jié)果算出氨基酸的含量。若樣品中含有多種氨基酸（如蛋白質(zhì)水解液），則不能由此法算出氨基酸的含量。大腸桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定一定量的微生物，接種在適合的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)，以菌數(shù)的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，做出的曲線叫生長(zhǎng)曲線。一般可分為延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)時(shí)期。不同的微生物有不同的生長(zhǎng)曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)曲線也不一樣。因此，測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線對(duì)于了解和掌握微生物的生長(zhǎng)規(guī)律是很有幫助的。測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線的方法很多，有血球計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法、稱重法、比濁法等。本實(shí)驗(yàn)采用比濁法測(cè)定，由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用光電比色計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來(lái)推知菌液的濃度，并將所測(cè)得的光密度值（OD值）與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線?，F(xiàn)已有直接用試管就可以測(cè)定OD值的光電比色計(jì),只要接種一支試管，定期用它測(cè)定，便可做出該菌的生長(zhǎng)曲線。查閱相關(guān)資料確定最佳培養(yǎng)基組成為

成分葡萄糖酵母膏蛋白胨(魚(yú)粉)(NH4)2S04K2HP04-3H2OKH2PO4MgS04微量元素母液(g／L)10.011.519.54.018．03.01.21.0實(shí)驗(yàn)室提供的發(fā)酵罐容積為50L,可根據(jù)上圖中各成分的配比,確定最后所需要的量成分葡萄糖酵母膏蛋白胨(魚(yú)粉)(NH4)2S04K2HP04-3H2OKH2PO4MgS04微量元素母液g500.0575.0975200.0900.0150.060.050.0確定了最佳培養(yǎng)條件為：溫度37℃、培養(yǎng)基裝液量35ml/250mL、培養(yǎng)基初始pH7．1、種子培養(yǎng)時(shí)間8h、接種量1％。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，發(fā)酵18h，菌體密度A600達(dá)到12．8，茵體干重為4．7g(DCW)／L，酶活力達(dá)到210U／mL發(fā)酵液，分別為初始條件下的3．1和14．9倍。采用分批補(bǔ)料的方法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵發(fā)酵流程與控制大腸桿菌的凍存復(fù)蘇培養(yǎng)液氮保藏--20°C保藏保藏培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基一級(jí)平板二級(jí)平板液體培養(yǎng)基一級(jí)搖瓶二級(jí)搖瓶LB培養(yǎng)基底物培養(yǎng)基補(bǔ)料培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基菌種復(fù)壯菌種保藏菌種培養(yǎng)發(fā)酵流程的基本框架發(fā)酵初始維持電機(jī)轉(zhuǎn)速300rpm以便對(duì)菌體維持較小的剪切力，通氣量維持在12L/min左右。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)液中葡萄糖耗盡,溶氧和pH驟增,采用流加方式連續(xù)流加葡萄糖和氮源維持菌體生長(zhǎng)。同時(shí)用25%氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH維持在6.8。分批培養(yǎng)(Batch)階段

補(bǔ)料分批培養(yǎng)(Fedbatch)階段發(fā)酵分為三個(gè)階段:而后溶氧逐漸下降，分步提高轉(zhuǎn)速,控制溶氧在30%以上。隨著菌體的大量繁殖，溶氧濃度迅速下降，當(dāng)溶氧低于20%時(shí)，手動(dòng)調(diào)節(jié)空氣流量直至最大，18L/min反饋控制補(bǔ)料基于溶解氧恒定的反饋控制策略：當(dāng)發(fā)酵液中底物幾乎耗盡時(shí)，氧消耗速率會(huì)下降，溶解氧會(huì)突然升高，因此，溶解氧的突然變化可以成為底物補(bǔ)料開(kāi)始的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)采取溶氧反饋調(diào)節(jié)措施，具體操作如下：發(fā)酵初始維持電機(jī)轉(zhuǎn)速300rpm以便對(duì)菌體維持較小的剪切力，通氣量維持在12L/min左右。由于本實(shí)驗(yàn)缺少調(diào)節(jié)空氣流量的電子閥裝置，對(duì)空氣流量只能采取手動(dòng)設(shè)置，隨著菌體的大量繁殖，溶氧濃度迅速下降，當(dāng)溶氧低于20%時(shí)，手動(dòng)調(diào)節(jié)空氣流量直至最大，18L/min。而后采取提高攪拌轉(zhuǎn)速方法，提高溶氧，具體操作為當(dāng)溶氧低于20%時(shí)，發(fā)酵控制器輸出信號(hào)，驅(qū)動(dòng)電機(jī)每次提高轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)，直至轉(zhuǎn)速達(dá)到最高轉(zhuǎn)速，1500rpm。最優(yōu)解響應(yīng)面分析在眾多實(shí)驗(yàn)因素中找出主要因素應(yīng)用正交試驗(yàn)（因素比較少）和PB（Plackett-Burman）實(shí)驗(yàn)。尤其是PB實(shí)驗(yàn)，它可以在很多的因素中，用較少的實(shí)驗(yàn)篩選出主要因素（一般選取大于90%）。通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)還可以看出各因素的作用效果，即是增加還是減少濃度會(huì)使響應(yīng)值向最優(yōu)移動(dòng)。主要因素的取值逼近中心點(diǎn)，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

這步實(shí)驗(yàn)不是必須做的，如果你確定你的實(shí)驗(yàn)取值已經(jīng)逼近中心點(diǎn)，那么你可以直接進(jìn)行第三步的分析。但是你要是不能確定或不相信這些取值那你就要進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。這步實(shí)驗(yàn)根據(jù)第一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。為了盡快逼近最優(yōu)值，增加步長(zhǎng)通常取最大響應(yīng)面分析

常用的有中心復(fù)合法和BB法（Box-Behnken）。在這步實(shí)驗(yàn)時(shí)最好因素不要太多，因素太多直接影響到試驗(yàn)次數(shù)，現(xiàn)在經(jīng)典的一般是三因素。通過(guò)這步分析可以的回歸方程，進(jìn)而得到最優(yōu)培養(yǎng)基。并且還能得到因素相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。發(fā)酵注意事項(xiàng)

1.發(fā)酵染菌發(fā)酵染菌的問(wèn)題實(shí)在是個(gè)令人頭疼的問(wèn)題，在這僅僅介紹一點(diǎn)簡(jiǎn)單的方滕來(lái)判斷染菌：通過(guò)理化參數(shù)進(jìn)行判斷，一般僅用于無(wú)菌培養(yǎng)檢查。如PH、DO通過(guò)聞發(fā)酵液的漁味，每個(gè)菌種都有自身的漁味，當(dāng)有臭味或者酸臭味時(shí)幬可基本判定。.無(wú)菌培養(yǎng)時(shí)也可通過(guò)滿溫的突然消漲，罐壓的突然升高等現(xiàn)象來(lái)判斷。④.通過(guò)鏡檢來(lái)觀察。⑤.通過(guò)劃平板。2.甘油保存菌種常用最終濃度10%-30%的甘油.由于純甘油十分粘稠很難定量.使用時(shí)按50%甘油:菌液=1:1混合均勻，然后迅速凍結(jié)。如果是大腸桿菌保種，甘油終濃度為15%.3.無(wú)菌操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室