發(fā)酵車間課程設計

發(fā)酵車間課程設計10生物技術第二組主講人:課題

大腸桿菌的高密度發(fā)酵要求50L發(fā)酵罐大綱大腸桿菌介紹發(fā)酵介紹高密度發(fā)酵介紹實驗數據及條件的確定發(fā)酵流程與控制發(fā)酵注意事項大腸桿菌介紹腸埃希氏菌(E.coli)通常稱為大腸桿菌，是Escheric在1885年發(fā)現的大腸桿菌是細菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細胞壁，只含有核糖體簡單的細胞器，沒有細胞核有擬核；細胞質中的質粒常用作基因工程中的運載體大腸桿菌的代謝類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。大腸桿菌在生物技術中的應用：大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，技術操作簡單，培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵經濟，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應用最廣泛，最成功的表達體系，常做高效表達的首選體系在培養(yǎng)基培養(yǎng)時無需添加生長因子，向培養(yǎng)基中加入伊紅美藍遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在在這里必須指出的是，處于生物安全考慮，生物工程用的菌株是在不斷篩選后被挑選出的菌株。這些菌株由于失去的細胞壁的重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。這樣，即便由于操作不慎導致活菌從實驗室流出，也不易導致生化危機。發(fā)酵介紹有機物被生物體氧化降解成氧化產物并釋放能量的過程統(tǒng)稱為生物氧化.微生物生理學把生物氧化區(qū)分為呼吸和發(fā)酵，呼吸又可進一步區(qū)分為有氧呼吸和無氧呼吸。因此，發(fā)酵是生物氧化的一種方式。工業(yè)生產上籠統(tǒng)地把一切依靠微生物的生命活動而實現的工業(yè)生產均稱為“發(fā)酵”借用理工大學的發(fā)酵工程課件來對發(fā)酵設備進行直觀的認識發(fā)酵罐發(fā)酵的特點發(fā)酵過程一般來說都是在常溫常壓下進行的生物化學反應，反應安全，要求條件也比較簡單。發(fā)酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農副產品為主，只要加入少量的有機和無機氮源就可進行反應。發(fā)酵過程是通過生物體的自動調節(jié)方式來完成的，反應的專一性強，因而可以得到較為單—的代謝產物三種發(fā)酵操作方式介紹分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵分批補料發(fā)酵分批發(fā)酵分批發(fā)酵又稱為分批培養(yǎng)，是指在一個密閉系統(tǒng)內投入有限數量的營養(yǎng)物質后，接入少量的微生物菌種進行培養(yǎng)，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的微生物培養(yǎng)方法。連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內的液量維持恒定的發(fā)酵過程。連續(xù)發(fā)酵可分為單罐連續(xù)發(fā)酵和多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵等方式。分批補料發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵是指以一定的速度向發(fā)酵罐內添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內的液量維持恒定的發(fā)酵過程。連續(xù)發(fā)酵可分為單罐連續(xù)發(fā)酵和多罐串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵等方式。高密度發(fā)酵介紹高細胞密度發(fā)酵(highcelldensitycultivation，HCDC)是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，獲得最多的細胞量，由此更多地或更高效地獲得目的產物。即利用一定的培養(yǎng)技術和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，最終提高產物的比生產率(單位體積單位時間內產物的產量)。通常認為菌體密度超過50g(DCW)/L即為高密度發(fā)酵。根據Riesenbere計算，理論上大腸桿菌發(fā)達到酵所能的最高菌體密度為400g(DCW/L)，考慮到實際情況中的種種條件限制，Markel等認為最高的菌體密度為200g(DCW/L)，此時發(fā)酵液的25%充滿了長3μm，寬1μm的大腸桿菌，發(fā)酵液粘度很高，幾乎喪失流動性。影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的因素培養(yǎng)基溶氧濃度PH溫度代謝副產物培養(yǎng)基高密度發(fā)酵對基質中營養(yǎng)源的種類和含量比要求較高，如碳源和氮源的比例偏小，會導致菌體生長旺盛，造成菌體提前衰老自溶；比例偏大，則菌體繁殖數量少，細胞代謝不平衡，不利于產物積累。葡萄糖是高密度發(fā)酵中常用的碳源，但濃度過高，會產生乙酸，因此要保證較低的葡萄糖濃度。氮源、微量元素和無機鹽對細菌的生長繁殖和外源蛋白的表達也有很大影響。溶氧濃度隨著發(fā)酵時間的延長，菌體密度迅速增加，溶氧濃度隨之下降，細胞的生長減慢。特別是高密度發(fā)酵的后期，由于菌體密度的擴增，耗氧量極大，發(fā)酵罐各項物理參數均不能滿足對氧的供給，導致菌體生長極為緩慢，外源蛋白的表達量也較差。在發(fā)酵過程中保證適宜的溶氧濃度，必須確定發(fā)酵罐的通氣量和攪拌速度。PH大腸桿菌利用葡萄糖產酸產氣，特別是大量的乙酸和二氧化碳，使pH降低，必須調節(jié)pH在適宜的范圍。溫度培養(yǎng)溫度在適宜的范圍，對于溫控誘導表達的基因工程菌來說，誘導時機和持續(xù)時間對于重組蛋白的產量由很大影響。代謝副產物乙酸

二氧化碳葡萄糖的濃度超過某一閾值，會產生乙酸，或者比生長速率過高，供氧不足，也會產生乙酸。為降低培養(yǎng)基中代謝副產物的積累，可采用流加補料的措施，或保持適當的比生長速率，或在培養(yǎng)基中添加某些氨基酸。實驗數據及條件的確定首先了解幾種測定方法還原糖的測定方法氨基酸的測定方法大腸桿菌生長曲線測定還原糖的測定

還原糖是具有羰基（＞C＝O）的糖，能將其他物質還原而其本身被氧化。(1)還原糖在堿性條件下加熱，在酒石酸鉀鈉存在的情況下，可以定量地將二價銅離子還原為一價銅離子，即產生磚紅色的氧化亞銅沉淀，其本身被氧化。具體反應如下：(2)氧化亞銅在酸性條件下，可將鉬酸銨還原，還原型的鉬酸銨再與砷酸氫二鈉起作用，生成一種藍色復合物即砷鉬藍，其顏色深淺在一定范圍內與還原糖含量（即被還原的Cu2O量）成正比，用標準葡萄糖與砷鉬酸作用，比色后用做標準，就可測得樣品中還原糖含量。氨基酸含量測定以甲醛滴定法測定氨基酸含量為例進行簡單說明水溶液中的氨基酸為兼性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。甲醛可與氨基酸上的—N+H3結合，形成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羥甲基衍生物，使N+H3上的H+游離出來，這樣就可以用堿滴定N+H3放出H+，測出氨基氮，從而計算氨基酸的含量。若樣品中只含有單一的已知氨基酸，則可由此法滴定的結果算出氨基酸的含量。若樣品中含有多種氨基酸（如蛋白質水解液），則不能由此法算出氨基酸的含量。大腸桿菌生長曲線測定一定量的微生物，接種在適合的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)，以菌數的對數作縱坐標，生長時間作橫坐標，做出的曲線叫生長曲線。一般可分為延遲期、對數期、穩(wěn)定期和衰亡期四個時期。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數法、平板菌落計數法、稱重法、比濁法等。本實驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用光電比色計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測得的光密度值（OD值）與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線?，F已有直接用試管就可以測定OD值的光電比色計,只要接種一支試管，定期用它測定，便可做出該菌的生長曲線。查閱相關資料確定最佳培養(yǎng)基組成為

成分葡萄糖酵母膏蛋白胨(魚粉)(NH4)2S04K2HP04-3H2OKH2PO4MgS04微量元素母液(g／L)10.011.519.54.018．03.01.21.0實驗室提供的發(fā)酵罐容積為50L,可根據上圖中各成分的配比,確定最后所需要的量成分葡萄糖酵母膏蛋白胨(魚粉)(NH4)2S04K2HP04-3H2OKH2PO4MgS04微量元素母液g500.0575.0975200.0900.0150.060.050.0確定了最佳培養(yǎng)條件為：溫度37℃、培養(yǎng)基裝液量35ml/250mL、培養(yǎng)基初始pH7．1、種子培養(yǎng)時間8h、接種量1％。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，發(fā)酵18h，菌體密度A600達到12．8，茵體干重為4．7g(DCW)／L，酶活力達到210U／mL發(fā)酵液，分別為初始條件下的3．1和14．9倍。采用分批補料的方法對大腸桿菌進行高密度發(fā)酵發(fā)酵流程與控制大腸桿菌的凍存復蘇培養(yǎng)液氮保藏--20°C保藏保藏培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基一級平板二級平板液體培養(yǎng)基一級搖瓶二級搖瓶LB培養(yǎng)基底物培養(yǎng)基補料培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基菌種復壯菌種保藏菌種培養(yǎng)發(fā)酵流程的基本框架發(fā)酵初始維持電機轉速300rpm以便對菌體維持較小的剪切力，通氣量維持在12L/min左右。當發(fā)酵培養(yǎng)液中葡萄糖耗盡,溶氧和pH驟增,采用流加方式連續(xù)流加葡萄糖和氮源維持菌體生長。同時用25%氨水自動調節(jié)pH維持在6.8。分批培養(yǎng)(Batch)階段

補料分批培養(yǎng)(Fedbatch)階段發(fā)酵分為三個階段:而后溶氧逐漸下降，分步提高轉速,控制溶氧在30%以上。隨著菌體的大量繁殖，溶氧濃度迅速下降，當溶氧低于20%時，手動調節(jié)空氣流量直至最大，18L/min反饋控制補料基于溶解氧恒定的反饋控制策略：當發(fā)酵液中底物幾乎耗盡時，氧消耗速率會下降，溶解氧會突然升高，因此，溶解氧的突然變化可以成為底物補料開始的標志。本實驗采取溶氧反饋調節(jié)措施，具體操作如下：發(fā)酵初始維持電機轉速300rpm以便對菌體維持較小的剪切力，通氣量維持在12L/min左右。由于本實驗缺少調節(jié)空氣流量的電子閥裝置，對空氣流量只能采取手動設置，隨著菌體的大量繁殖，溶氧濃度迅速下降，當溶氧低于20%時，手動調節(jié)空氣流量直至最大，18L/min。而后采取提高攪拌轉速方法，提高溶氧，具體操作為當溶氧低于20%時，發(fā)酵控制器輸出信號，驅動電機每次提高轉速20轉，直至轉速達到最高轉速，1500rpm。最優(yōu)解響應面分析在眾多實驗因素中找出主要因素應用正交試驗（因素比較少）和PB（Plackett-Burman）實驗。尤其是PB實驗，它可以在很多的因素中，用較少的實驗篩選出主要因素（一般選取大于90%）。通過PB實驗還可以看出各因素的作用效果，即是增加還是減少濃度會使響應值向最優(yōu)移動。主要因素的取值逼近中心點，最陡爬坡實驗

這步實驗不是必須做的，如果你確定你的實驗取值已經逼近中心點，那么你可以直接進行第三步的分析。但是你要是不能確定或不相信這些取值那你就要進行最陡爬坡實驗。這步實驗根據第一步實驗進行。為了盡快逼近最優(yōu)值，增加步長通常取最大響應面分析

常用的有中心復合法和BB法（Box-Behnken）。在這步實驗時最好因素不要太多，因素太多直接影響到試驗次數，現在經典的一般是三因素。通過這步分析可以的回歸方程，進而得到最優(yōu)培養(yǎng)基。并且還能得到因素相互作用對響應值的影響。發(fā)酵注意事項

1.發(fā)酵染菌發(fā)酵染菌的問題實在是個令人頭疼的問題，在這僅僅介紹一點簡單的方滕來判斷染菌：通過理化參數進行判斷，一般僅用于無菌培養(yǎng)檢查。如PH、DO通過聞發(fā)酵液的漁味，每個菌種都有自身的漁味，當有臭味或者酸臭味時幬可基本判定。.無菌培養(yǎng)時也可通過滿溫的突然消漲，罐壓的突然升高等現象來判斷。④.通過鏡檢來觀察。⑤.通過劃平板。2.甘油保存菌種常用最終濃度10%-30%的甘油.由于純甘油十分粘稠很難定量.使用時按50%甘油:菌液=1:1混合均勻，然后迅速凍結。如果是大腸桿菌保種，甘油終濃度為15%.3.無菌操作注意事項實驗進行前，無菌室