多重不對稱擴(kuò)增介紹

多重不對稱PCR

黃桃生（生物芯片組）多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!多重不對稱PCR多重PCR(MultiplexPCR)不對稱PCR（AsymmetricPCR）獲得大量不同片段的單鏈DNA（SSDNA）多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同.1、擴(kuò)增單一基因中多個片段（華法林檢測）2、擴(kuò)增不同基因中多個片段（HPV分型）多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!多重PCR技術(shù)難點(diǎn)反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同.難點(diǎn)主要體現(xiàn)在前期引物設(shè)計(jì)過程中——反應(yīng)體系的平衡

多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!引物特異性如果引物與體系中其他非目的基因片段結(jié)合能力更強(qiáng)，那么目的基因結(jié)合引物的能力就會受到競爭，從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降。嚴(yán)格blast驗(yàn)證多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!引物二聚體包括引物間的二聚體以及引物自身所形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，還有一類是第三方DNA介導(dǎo)的二聚體，這些二聚體和非特異引物一樣都會干擾引物與目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的競爭，影響擴(kuò)增效率。針對不同對引物之間二聚體，目前可以采用VisualOMP6軟件（7天試用版）進(jìn)行驗(yàn)證。多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!不對稱PCR用不等量的一對引物進(jìn)行模板的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA。這對引物分別稱為非限制性引物和限制性引物。在擴(kuò)增過程前10-20個循環(huán)，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗殆盡，不再引導(dǎo)擴(kuò)增，而非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR會繼續(xù)進(jìn)行，從而就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA。多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!不對稱PCR設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)不對稱PCR引物時(shí)，限制性引物的Tm值較非限制性引物Tm值高4~6°，擴(kuò)增效果更佳。不對稱PCR設(shè)計(jì)在于控制限制性引物（低濃度引物）的絕對量，限制性引物過多或過少，均不利于SSDNA的制備。限制性引物量可以考慮設(shè)置在0.8-1.5P之間。設(shè)置限制性引物量后，再通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證限制性引物濃度和非限制性引物濃度的比例，目前常用比例1:3、1:5、1:10、1:15、1:20進(jìn)行優(yōu)化，一般情況下，1:10、1:20比例情況下效果可能更佳。多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!多重不對稱PCR重要影響因素引物二聚體引物特異性

主要是導(dǎo)致不對稱PCR限制性引物和非限制性引物比例的改變，或者限制性引物絕對量的改變，從而導(dǎo)致擴(kuò)增差異化或者擴(kuò)增失敗。多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!多重不對稱PCR步驟引物設(shè)計(jì)（PP5/OLIGO6)BLAST驗(yàn)證引物特異性O(shè)MP軟件驗(yàn)證引物二聚體評價(jià)每對引物進(jìn)行單擴(kuò)并驗(yàn)證不對稱擴(kuò)增引物最佳比例將所有引物并入一貫體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證選出出現(xiàn)問題的引物進(jìn)行重新設(shè)計(jì)多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!多重PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)高效性：在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。系統(tǒng)性：多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞厭氧菌等同時(shí)檢測。經(jīng)濟(jì)簡便性：多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!反應(yīng)體系不平衡反應(yīng)體系的不平衡導(dǎo)致在前期的幾輪反應(yīng)中某些優(yōu)勢引物及其模板迅速擴(kuò)增，獲得大量的擴(kuò)增產(chǎn)物，而這些擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)又是DNA聚合酶的良好抑制劑（SantaLucia,2007）。所以，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的大量出現(xiàn)，聚合酶的聚合能力被越來越強(qiáng)烈的抑制住了，因此，前期處于劣勢的引物及其模板，這時(shí)就更加舉步維艱，最終導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量非常之小，以至于無法檢測。正所謂"強(qiáng)者更強(qiáng)、弱者更弱"。導(dǎo)致不平衡的原因：

1、引物特異性；2、最佳退火溫度不一致；3、引物二聚體；4、模板量不同；5、引物擴(kuò)增效率多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!最佳退火溫度不一致將多對引物放置入一個體系中擴(kuò)增，由于進(jìn)行PCR反應(yīng)的退火溫度相同，所以要求每一對引物的最佳退火溫度接近。前期引物設(shè)計(jì)時(shí)減少最佳退火溫度的差異，最佳退火溫度的差異不超過3~5°為宜。多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!引物擴(kuò)增效率這個因素很重要，但也很籠統(tǒng)，它也許包含了上面提到的幾個因素，但更多的因素還不清楚。引物的擴(kuò)增效率到目前為止，還沒有一個可以明確的定量計(jì)算方法。目前也有文章提出使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，利用qPCR的數(shù)據(jù)建立一個模型，來預(yù)測引物與目標(biāo)序列的擴(kuò)增效率。srvgen.upct.es/efficiency.html多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!不對稱PCR優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)可以獲得大量SSDNA，快速進(jìn)行下游操作。比如直接進(jìn)行測序，或者下游雜交檢測無需經(jīng)過變性這一步驟。缺點(diǎn)前期10-20循環(huán)相當(dāng)于對稱擴(kuò)增，單鏈DNA在此之后才會出現(xiàn)，從而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加，靈敏度較對稱性擴(kuò)增低。不對稱擴(kuò)增對于低拷貝樣本的擴(kuò)增較難，對于病原體檢測需要更詳盡的PCR設(shè)計(jì)和優(yōu)化。多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!增加單鏈的方法1、納米金微粒介導(dǎo)不對稱擴(kuò)增

納米金顆?？梢栽鰪?qiáng)PCR擴(kuò)增效率和特異性，有可能是由于金納米顆粒與單鏈引物之間特異性結(jié)合，類似單鏈結(jié)合蛋白SSB功能，一直PCR非特異性擴(kuò)增，更重要的可能是，金納米顆粒的熱效率和熱傳導(dǎo)，在液相中，納米顆粒可以快速傳遞熱量并且與周圍環(huán)境在10~200ps內(nèi)形成熱平衡，增強(qiáng)擴(kuò)增效率。通過金納米顆粒介導(dǎo)進(jìn)行的不對稱PCR，可以獲得與普通不對稱PCR更好的效果。2、LATE-PCR(Linear-After-The-ExponentialPCR)多重不對稱擴(kuò)增介紹共18頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!多重不對稱PCR設(shè)計(jì)軟件PrimerPlex（付費(fèi)）——一款設(shè)計(jì)特征寡核苷酸片斷、用于同時(shí)分析100種核酸序