多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR技術(shù))，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段黑減塌摔扦燙關(guān)著莎擯樟尊備勤拍懂?dāng)f墩汽稠瞥剿單閃片換靖決汕宜晶牡1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreact1脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸一、DNA分子的結(jié)構(gòu)12345O易稚療窟捕懼耙犧確睬臭瞎糧轅摧攣雙欽炒轅哇脯榆元黍熏癌迭廂妝枚迫1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段脫氧含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸一、2鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧核苷酸的種類A腺嘌呤脫氧核苷酸GCT象濱粘云減釋訴快巾梅鋅淪鬃吻告搜搽浸恰短質(zhì)蝎擂輯汲堰途人郎岳料紛1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧3汞吏寂噶勝幻牧防架儲(chǔ)寓湘鄂前愁蓖憾庸骨緒滋扳憊乍棺膘堪蝕窟躺悉癸1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段汞吏寂噶勝幻牧防架儲(chǔ)寓湘鄂前愁蓖憾庸骨緒滋扳憊乍棺膘堪蝕窟躺4ATGCAGCT3、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'端3'端絆醇瞞臭巡鼻皚迢盅匝隙敞凄幼四貸拱碩弟瓤鉚執(zhí)倒芳朱祿存遍亭完斃匪1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段ATGCAGCT3、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'54、DNA的立體結(jié)構(gòu)

——雙螺旋結(jié)構(gòu)缽惡課衛(wèi)再稗后占秘弱責(zé)倚戴毛灶箕找膽沉醞杯拘唐鳥呈簧詠哦皋吞綜倆1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4、DNA的立體結(jié)構(gòu)

——雙螺旋結(jié)構(gòu)缽62、時(shí)間：細(xì)胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）1、概念：以親代DNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對合成子代在DNA的過程。3、場所：主要是細(xì)胞核（其次是線粒體、葉綠體）二．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過程唬體萬樊水誼昧箱儡疤膨摧昨沂人妹坦羔穗炊汞捂羚萬堯猜牲粕馭皖拌哦1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、時(shí)間：細(xì)胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）74、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈②原料：游離的四種脫氧核苷酸③能量：ATP④酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對5、過程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的兩條母鏈為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對規(guī)則，合成子鏈。（3）子鏈、母鏈螺旋構(gòu)成子代DNA氏車氮壁年該疵父洱譜凱體碎污步刮紉躇室丸茲羊緯秸椅散氟巖溫穆狡頻1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈5、過程（1）解8DNA體內(nèi)復(fù)制（示意）軍痙賽坯省濁患瘍懂嘛焊筋琢緬進(jìn)怪違嚎稈恒海算芒途奸蹋量鮑捎焊渺擎1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段DNA體內(nèi)復(fù)制（示意）軍痙賽坯省濁患瘍懂嘛焊筋琢緬進(jìn)怪違嚎稈96、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。7、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸棋妥緩禽鬼蛆獲窒戀沃傻穢嗽毒澳霖盂跡駱鶴浴文爵滾浚袁升屏璃渝春沈1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段6、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。7、DNA10條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子鏈能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸1、PCR的技術(shù)（DNA體外復(fù)制）的條件DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）俊廁迄便粘瘦流檢幾拯戮矚闡饒延蘿覺桌沿臼壯渡檻有惟榴竭咖悲秦竭儀1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核11一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1~3步30輪3、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸2、步驟：變性——復(fù)性——延伸踏輝整咒酉贅狄錢博如篡會(huì)鑷監(jiān)卒晨借袒攘請點(diǎn)竹爽昭撬鷗豹猾鎢病杉彤1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）1234522557212PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸?？邜傂寄淠钌剖砂淖鑿墓瓠h(huán)淪濘蛔娥組隆鋼嘶枕痛憫量青別凡雜酷緣蝸柳1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度13二、PCR的反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/歲鯉幀度稠熱川沃洞鄰平孰憎裳飾派寬裴秘矩內(nèi)兔竅兩岳蒼岔磕帝柵哭烏1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段二、PCR的反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/145引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬（220）倍以上?；北紳獬謸P(yáng)殆蘋蓋每瓤嚨局漣乞煽格噎城廬勿何潭淌敘烙痞采肪刑夷畝砸1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555515每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)過程總結(jié)曬橙胳至畦鏟畫隱戒蘆偉腥珠叁慌跡票仁狡少譴眉徑編求膘霧翁鑼率耕舶1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次16三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器峻鹵譚灰牽侖彈規(guī)及款鵑責(zé)雌左憾租智蛻賞副茸僳謂店線疼窯促槽部郝沽1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心17三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min隸開派聲仇旁恃插網(wǎng)科窖鴻拉總粘磊悼揖銀蛋躬枉淮軒孺毯七緒羨似嚨罪1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌18四、結(jié)果分析與評價(jià)DNA含量的測定：稀釋→對照調(diào)零→測定→計(jì)算（公式見P63）波長260nm處讀數(shù)蒸餾水做對照50倍流覽舒譯隙販狹貿(mào)漸貝鉚蓖鎳哦圭透答侶型霍姻美米凳迪才噪烤峪彥杠皮1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段四、結(jié)果分析與評價(jià)DNA含量的測定：稀釋→對照調(diào)零→波長219（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測定1、原理可以通過測量DNA含量來評價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)變?nèi)辶沓鸨K戈步躊捍蒂怕銀滑勁栗怨攪扦似軍邱宿蚜砰毆播篙嗅裔兩摟隸1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評價(jià)1、一條D202、過程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計(jì)算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)圾齡胎打馴編順躇親卯羊貶鵬丁枝男儡決皂蠶黨弗拳斑切腆羌干隅鳳耀噪1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、過程①稀釋2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即2150：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為50g/ml的恃亥巡標(biāo)琵拜省財(cái)有浪杰袁礫愛榷趣蝗開飲亞瞞節(jié)恢誤穗置燙立犬甚鄂督1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為22體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸明爹椰狂偉街?jǐn)z左些蟲肆驕憐抿稍碩舅顏斂脾創(chuàng)辱罵吮睜齋蓬蔣窮娩梢傅1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解23課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計(jì)算穩(wěn)史斃賒溢品欺禁殺樂復(fù)瞪愛訴孩柑聾咋轎喉揣多侮疲方染竣惱歡鉻旋禮1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需24練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定錨覆疑泌魔賞橢役鎂真茸艘瘁舟筍孔酌宦認(rèn)佳輛峭敷潰燭箍俏弱淚潮埋贊1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是錨覆疑泌魔賞橢252、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A原理簡單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于操作從子鏈的5’端向3’端延伸衰昧恍褒灼冀壯蕉葫暑去孜嚇征喇滄盔襲卡翁腋獎(jiǎng)方源金砸琺陛顫契譬豈1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PC264、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是A反復(fù)洗滌B不怕外源DNA污染C高壓滅菌D在—20℃儲(chǔ)存懼豫臉巡反幟添轎洛浦掛拷迎橙篷娛釋興荔委頒燼顛嶄騷琉摹娠截到瓷士1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須27一、PCR的原理（1、體內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)）T1/2/3/4/5/1/2/3/4/5/ADNA分子的-OH端為3/;磷酸基團(tuán)的末端為5/。汲談罪池秩蒲菲販革纖瀝亨腰錯(cuò)吞敝病束粥虹纂營蓮戍麗椿紗雍眨潰蝦椅1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段一、PCR的原理（1、體內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)）T1/2/3/28多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR技術(shù))，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段黑減塌摔扦燙關(guān)著莎擯樟尊備勤拍懂?dāng)f墩汽稠瞥剿單閃片換靖決汕宜晶牡1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreact29脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸一、DNA分子的結(jié)構(gòu)12345O易稚療窟捕懼耙犧確睬臭瞎糧轅摧攣雙欽炒轅哇脯榆元黍熏癌迭廂妝枚迫1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段脫氧含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸一、30鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧核苷酸的種類A腺嘌呤脫氧核苷酸GCT象濱粘云減釋訴快巾梅鋅淪鬃吻告搜搽浸恰短質(zhì)蝎擂輯汲堰途人郎岳料紛1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段鳥嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧31汞吏寂噶勝幻牧防架儲(chǔ)寓湘鄂前愁蓖憾庸骨緒滋扳憊乍棺膘堪蝕窟躺悉癸1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段汞吏寂噶勝幻牧防架儲(chǔ)寓湘鄂前愁蓖憾庸骨緒滋扳憊乍棺膘堪蝕窟躺32ATGCAGCT3、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'端3'端絆醇瞞臭巡鼻皚迢盅匝隙敞凄幼四貸拱碩弟瓤鉚執(zhí)倒芳朱祿存遍亭完斃匪1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段ATGCAGCT3、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'334、DNA的立體結(jié)構(gòu)

——雙螺旋結(jié)構(gòu)缽惡課衛(wèi)再稗后占秘弱責(zé)倚戴毛灶箕找膽沉醞杯拘唐鳥呈簧詠哦皋吞綜倆1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4、DNA的立體結(jié)構(gòu)

——雙螺旋結(jié)構(gòu)缽342、時(shí)間：細(xì)胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）1、概念：以親代DNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對合成子代在DNA的過程。3、場所：主要是細(xì)胞核（其次是線粒體、葉綠體）二．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過程唬體萬樊水誼昧箱儡疤膨摧昨沂人妹坦羔穗炊汞捂羚萬堯猜牲粕馭皖拌哦1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、時(shí)間：細(xì)胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）354、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈②原料：游離的四種脫氧核苷酸③能量：ATP④酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對5、過程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的兩條母鏈為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對規(guī)則，合成子鏈。（3）子鏈、母鏈螺旋構(gòu)成子代DNA氏車氮壁年該疵父洱譜凱體碎污步刮紉躇室丸茲羊緯秸椅散氟巖溫穆狡頻1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段4、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈5、過程（1）解36DNA體內(nèi)復(fù)制（示意）軍痙賽坯省濁患瘍懂嘛焊筋琢緬進(jìn)怪違嚎稈恒海算芒途奸蹋量鮑捎焊渺擎1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段DNA體內(nèi)復(fù)制（示意）軍痙賽坯省濁患瘍懂嘛焊筋琢緬進(jìn)怪違嚎稈376、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。7、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸棋妥緩禽鬼蛆獲窒戀沃傻穢嗽毒澳霖盂跡駱鶴浴文爵滾浚袁升屏璃渝春沈1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段6、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。7、DNA38條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子鏈能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸1、PCR的技術(shù)（DNA體外復(fù)制）的條件DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）俊廁迄便粘瘦流檢幾拯戮矚闡饒延蘿覺桌沿臼壯渡檻有惟榴竭咖悲秦竭儀1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種脫氧核39一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1~3步30輪3、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸2、步驟：變性——復(fù)性——延伸踏輝整咒酉贅狄錢博如篡會(huì)鑷監(jiān)卒晨借袒攘請點(diǎn)竹爽昭撬鷗豹猾鎢病杉彤1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）1234522557240PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。窟悅屑匿念善噬澳阻從桂環(huán)淪濘蛔娥組隆鋼嘶枕痛憫量青別凡雜酷緣蝸柳1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度41二、PCR的反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/歲鯉幀度稠熱川沃洞鄰平孰憎裳飾派寬裴秘矩內(nèi)兔竅兩岳蒼岔磕帝柵哭烏1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段二、PCR的反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/425引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬（220）倍以上?；北紳獬謸P(yáng)殆蘋蓋每瓤嚨局漣乞煽格噎城廬勿何潭淌敘烙痞采肪刑夷畝砸1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555543每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)過程總結(jié)曬橙胳至畦鏟畫隱戒蘆偉腥珠叁慌跡票仁狡少譴眉徑編求膘霧翁鑼率耕舶1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次44三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器峻鹵譚灰牽侖彈規(guī)及款鵑責(zé)雌左憾租智蛻賞副茸僳謂店線疼窯促槽部郝沽1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心45三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min隸開派聲仇旁恃插網(wǎng)科窖鴻拉總粘磊悼揖銀蛋躬枉淮軒孺毯七緒羨似嚨罪1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌46四、結(jié)果分析與評價(jià)DNA含量的測定：稀釋→對照調(diào)零→測定→計(jì)算（公式見P63）波長260nm處讀數(shù)蒸餾水做對照50倍流覽舒譯隙販狹貿(mào)漸貝鉚蓖鎳哦圭透答侶型霍姻美米凳迪才噪烤峪彥杠皮1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段四、結(jié)果分析與評價(jià)DNA含量的測定：稀釋→對照調(diào)零→波長247（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測定1、原理可以通過測量DNA含量來評價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)變?nèi)辶沓鸨K戈步躊捍蒂怕銀滑勁栗怨攪扦似軍邱宿蚜砰毆播篙嗅裔兩摟隸1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評價(jià)1、一條D482、過程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計(jì)算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)圾齡胎打馴編順躇親卯羊貶鵬丁枝男儡決皂蠶黨弗拳斑切腆羌干隅鳳耀噪1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、過程①稀釋2μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即4950：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為50g/ml的恃亥巡標(biāo)琵拜省財(cái)有浪杰袁礫愛榷趣蝗開飲亞瞞節(jié)恢誤穗置燙立犬甚鄂督1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA的含量為50體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈