SIRT1在賁門癌中的表達及臨床病理學意義研究

SIRT1在賁門癌中的表達及臨床病理學意義研究sirt1在賁門癌中的表達及臨床病理學意義研究【本文關鍵詞語】sirt1；賁門癌；預后【內容摘要】目的研究sirt1表達與賁門癌臨床病理學間的關系及對預后的影響。方法應用組織芯片技術和免疫組化方法檢測176例賁門癌組織和32例正常賁門組織中sirt1、p53、ki67蛋白的表達情況。結果sirt1在賁門癌中的陽性表達率高于正常賁門中的陽性表達率〔p0.01〕；176例賁門癌中，sirt1在淋逢迎有轉移組中的表達高于淋逢迎無轉移組〔p0.01〕;且sirt1表達與賁門癌tnm分期呈正相關〔p0.05〕。sirt1陽性組的ki67蛋白水平高于sirt1陰性組〔p0.05〕。其中90例有隨訪資料的賁門癌病例中，sirt1陽性患者的3年生存率及平均生存時間，低于sirt1陰性表達患者〔p0.05〕。結論sirt1在賁門癌組織中存在過表達，與淋逢迎轉移、tnm分期、腫瘤增殖狀況以及預后相關，可能成為斷定賁門癌惡性水平及評估預后的生物學指標。【本文關鍵詞語】sirt1；賁門癌；預后studyontheclinicopathologicsignificanceandexpressionofsirt1fenganning,fanxiangshan,huangqin,etal.departmentofpathology,gulouclinicalmedicalcollegeaffiliatedtonanjingmedicaluniversity,nanjing210008,china【abstract】objectivetoinvestigatetheexpressionofsirt1ingastriccardiacarcinomaanditscorrelationwithclinicopathologicfeaturesandpatients'prognosis.methodstissuemicroarray(tma)techniqueandimmunohistochemistrystainwereusedtodetecttheexpressionofsirt1,p53,andki67in176casesofgastriccardiacarcinomatissuesand32casesofnormalgastriccardiacregionsthepositiverateofsirt1expressioningastriccardiacarcinomacaseswassignificantlyhigherthanthatinnormalgastriccardiacregiontissues(p0.01);inthe176casesofgastriccardiacarcinoma,theexpressionofsirt1inlymphnodemetastasisgroupwassignificantlyhigherthanthatinthegroupwithoutlymphnodemetastasis(p0.01),whichwaspositivelycorrelatedtotnmstage(p0.05);theproteinlevelsofki67insirt1positivegroupweresignificantlyhigherthanthoseinsirt1negativegroup(p0.05).inthe90patientswithcompletefollowupinformation,thethree-yearsurvivalrateandmeansurvivaltimeofpatientswithpositivesirt1expressionweresignificantlylowerthanthoseofpatientswithnegativesirt1expression(p0.05).conclusionthereexistsoverexpressionofsirt1ingastriccardiacarcinoma,andthehighexpressionofsirt1iscorrelatedwithlymphaticmetastasis,tnmstage,proliferativestatusandpatients’prognosis.sirt1maybeabiologicalparametertoevaluatethemalignantdegreeofgastriccardiacarcinomaandtoforecastthepatients'prognosisofgastriccardiacarcinoma.【keywords】sirt1;gastriccardiacarcinoma;prognosis緘默信息調節(jié)因子2〔silentinformationregulator2,sir2〕是依靠于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸〔nicotinmideadentinedinucleotide,nad+〕的組蛋白去乙?；?，屬第ⅲ類去乙酰化酶。t1是sir2的哺乳動物同源物，在體內可將組蛋白及多種非組蛋白去乙?；?，調節(jié)基因表達及蛋白質功能，與神經變性疾病［1］、代謝相關疾?。?］的發(fā)生有關。最近研究顯示，sirt1在很多人類惡性腫瘤中表達上調［3，4］，提示其可能參與了腫瘤的構成及進展經過。賁門癌是發(fā)生于胃食管連接部〔gastroesophagealjunction,gej〕的惡性腫瘤，近年來因其發(fā)病率呈上升趨勢而遭到更多的關注。本研究以組織芯片技術及免疫組化染色方法，檢測sirt1、p53和ki67在賁門癌以及正常賁門部黏膜中的表達情況，分析sirt1表達與臨床病理學參數(shù)以及預后間的關系，討論sirt1在賁門癌發(fā)生進展中可能起到的作用。1資料與方法1.1一般資料標原來源于南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院2005至2007年賁門癌存檔標本176例，患者均為初次發(fā)現(xiàn)賁門癌，術前未經任何治療。176例患者中男132例，女44例；年齡41～90歲，平均年齡64歲；腫瘤最大直徑≥5cm89例，＜5cm87例；有淋逢迎轉移128例，無淋逢迎轉移48例。tnm分期ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ期分別為17、31、103、25例。按組織學類型分類，高分化腺癌1例，中分化腺癌79例，低分化腺癌79例,粘液細胞癌7例,粘液腺癌10例，所有病例資料完好，標本經10%中性甲醛溶液固定，慣例處理后石蠟包埋。對照組為賁門部正常胃黏膜組織32例，均經鏡下證明未被腫瘤細胞侵襲。176例中有90例具有3年隨訪資料。1.2組織芯片構建組織微陣列打孔系統(tǒng)購自美國beecherinstrument公司。所有病例復診后根據he切片標記出典型病變范圍，應用組織微陣列打孔儀在每例組織典型病變處取樣，分別移植至受體蠟塊上，取樣針直徑1mm，制成13×16個點的組織芯片蠟塊，連續(xù)4μm厚切片；按同樣方法構建另一個包括一樣病例且陣列設計一樣的組織芯片蠟塊以便實驗反復。1.3免疫組化染色組織芯片脫蠟至水，0.01mol/ledta〔ph=8〕高壓抗原修復，按照envision試劑盒說明書行免疫組化法染色。所用sirt1〔克隆號:e104〕購自美國sigma公司；p53〔克隆號：do7〕，ki67(克隆號：7b11)購自北京中杉公司。染色中采取pbs代替一抗作為陰性對照，已經知道陽性切片為陽性對照。每個檢測指標均在另一張組織芯片上反復1次。1.4結果斷定無背景著色情況下以胞核出現(xiàn)黃色或棕色顆粒者為陽性染色。如染色不連續(xù)，明顯減弱或缺失，則被斷定為不正常染色。對同一病例的腫瘤細胞陽性染色數(shù)量取2張組織芯片染色結果的平均值，并作為該病例最終評分。sirt1、p53結果斷定標準：腫瘤細胞中陽性染色數(shù)量≥30%為陽性結果，＜30%為陰性結果［5］；ki67結果斷定標準：記數(shù)陽性腫瘤細胞數(shù)所占的比例，以5%為單位進行半定量評估［6］。1.5統(tǒng)計學分析應用spss15.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采取χ2檢驗，相關性采取spearman相關分析，生存數(shù)據進行kaplanmeier分析，并繪制生存曲線圖，應用logrank檢驗差別性，p0.05為差別有統(tǒng)計學意義。2結果2.1sirt1在賁門癌組織和賁門部正常胃黏膜組織中的表達sirt1陽性著色定位于胞核，呈黃色或棕黃色〔圖1〕。176例賁門癌中呈陽性表達81例〔46.02%〕，32例賁門部正常黏膜中呈陽性表達6例〔18.75%〕，2組差別有統(tǒng)計學意義〔p0.01〕。2.2sirt1在賁門癌組織中表達與賁門癌臨床病理學參數(shù)間的關系176例賁門癌組織中，sirt1的表達在性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、組織學分化中差別無統(tǒng)計學意義〔p＞0.05〕，在淋逢迎轉移、分期方面差別有統(tǒng)計學意義〔p0.05或0.01〕，sirt1表達與賁門癌分期呈正相關〔rs=0.159,p0.05〕。見表1。表1sirt在賁門癌中的表達及其臨床病理學聯(lián)絡〔略〕2.3賁門癌中sirt1表達與p53及ki67表達的關系sirt1陽性表達病例中，p53陽性表達率為45.68%〔37/81〕，與sirt1陰性病例中的p53陽性率50.53%(48/95)相比，差別無統(tǒng)計學意義〔p0.05〕。ki67的li指數(shù)在sirt1陽性病例中平均值為46.1728,sirt1陰性病例中均值為38.0000，sirt1陽性病例中ki67的li均數(shù)高于sirt1陰性病例，差別具有統(tǒng)計學意義〔p=0.041〕。賁門癌中p53及ki67表達情況見圖2、3，sirt1與ki67及p53表達水平間的關系。見表2。表2賁門癌中sirt1的表達與p53，ki67之間的關系例〔略〕2.4sirt1的表達與賁門癌預后之間的關系176例賁門癌病例中，失訪86例。90例隨訪資料完好病例sirt1陽性者46例，1、2、3年生存率(survivalrate)分別為80.4%，59.7%,48.6%,平均生存時間(meansurvivaltime)為29.9個月；44例sirt1陰性表達病例的1、2、3年生存率分別為88.6%，78.6%,71%,平均生存時間為39.8個月。經logrank分析差別有統(tǒng)計學意義〔p0.024〕。生存曲線見圖4。3討論本研究結果提示，sirt1可能參與了賁門癌的構成和增殖，并可能成為判定腫瘤惡性水平及預后的指標。sirt1與細胞存活，分化,代謝，細胞凋亡和細胞周期等相關。細胞學實驗證明sirt1參與了腫瘤細胞的放化療耐受［7］，提示sirt1可能在腫瘤發(fā)生及進展中起到促進作用。本實驗結果顯示sirt1可能參與了賁門癌的發(fā)生和進展，其效應可能為促進作用。原由于：〔1〕sirt1在賁門癌組織中表達增高；〔2〕sirt1的表達與腫瘤細胞中的ki67水平呈正相關；〔3〕sirt1陽性病例比sirt1陰性病例預后差，且sirt1表達與腫瘤分期、淋逢迎轉移相關。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠結腸癌模型中，sirt1起到的作用是一個腫瘤抑制因子而非促進因子［8］，另外亦有研究發(fā)現(xiàn)sirt1在乳腺癌中表達為降低而非增高［9］，與本實驗結果相反。以上互相矛盾結論產生的原因可能是由于不同組織中sirt1表達含量及蛋白活性有差別，且sirt1的底物諸多，很多底物還尚待證明。p53在體內有野生型和突變型兩種。野生型p53蛋白具有抑癌作用，突變型p53編碼的蛋白由于喪失其抑癌功能，可導致細胞無限增殖而引發(fā)腫瘤。sirt1能通過對野生型p53蛋白第283位賴氨酸殘基的去乙酰化來下調p53活性，以減少dna損傷或應激條件下的細胞凋亡［10］，陳虹等［11］研究發(fā)現(xiàn)，p53基因的突變與食管賁門部多源癌的發(fā)生具有相關性。近年研究發(fā)現(xiàn)，p53突變與sirt1也有一定關系。jang等［5］用免疫組化方法檢測104例彌漫大b細胞淋巴瘤的p53和sirt1表達情況，發(fā)現(xiàn)p53和sirt1水平存在相關性，且都與生存率及生存期相關。由于免疫組化檢測到的都是突變型p53蛋白，由此結果揣測sirt1與p53突變在彌漫大b細胞淋巴瘤的預后中可能存在互相影響的協(xié)同作用。除此之外，突變型p53還可間接調控sirt1的表達，機制是通過調節(jié)mirna中的mir34a的水平，其中mir34a是非編碼rna中的一類，可影響sirt1基因的轉錄［12］。由以上研究結論揣測，突變型p53與sirt1之間可能存在著一種負反應聯(lián)絡，在無p53突變的腫瘤中，sirt1可能在癌變及進展中起到了關鍵作用。然而本實驗中，p53和sirt1的核染色情況未見顯著相關性，揣測在賁門癌中，sirt1與p53突變間的互相作用并不是其參與腫瘤構成的重要作用?？赡苁怯捎趕irt1在p53和sirt1表達的調節(jié)機制復雜，且腫瘤組織類型不同其發(fā)生機制也不同。當前研究支持sirt1促進了細胞增殖和腫瘤生長，機制為通過調控ras促分裂原活化蛋白激酶〔rasmitogenactivatedproteinkinase,rasmapk)［13］、erk/s6k1等［14］細胞信號通路的活性。本實驗結果與此結論一致。ki67是增殖細胞核抗原，其陽性著色的細胞百分比可用來客觀評價細胞的增殖狀況。本實驗中,賁門癌組織中sirt1陽性組的ki67水平明顯高于sirt1陰性組，表示清楚在sirt1陽性病例中，更多的腫瘤細胞處于增殖活潑踴躍狀況。此結果提示sirt1參與了賁門癌細胞增殖和生長，效應可能是促進作用而非抑制造用。近年來越來越多的關于賁門部腫瘤的研究被各國研究者報道，賁門癌在組織學、生長方式、表型、細胞分化等方面上具有多樣性特征［15］。和非賁門部癌相比，賁門癌多有淋逢迎轉移，預后更差［16］。至今尚無用于評估賁門癌預后的單獨指標。本實驗結果顯示，sirt1在有淋逢迎轉移病例中的陽性表達率，較無淋逢迎轉移病例中的陽性表達率高，差別具有統(tǒng)計學意義，且sirt1水平與tnm分期呈正相關，分期越高的賁門癌組織中sirt1陽性病例數(shù)越多，揣測sirt1可能通過某種機制促進腫瘤淋逢迎轉移，進而影響到腫瘤分期。另外，生存分析結果提示，sirt1陽性表達的病例其總生存期、3年生存率均低于sirt1陰性病例，提示sirt1陽性表達的腫瘤其惡性水平更高層次，預后較差。以上結果顯示，sirt1可能作為用來評估賁門癌惡性水平及臨床預后的生物學標記物?！疽韵聻閰⒖嘉墨I】1arakit,sasakiy,milbrandtj.increasednuclearnadbiosynthesisandsirt1activationpreventaxonaldegeneration.science,2004,305:10101013.2bordonel,mottamc,picardf,etal.sirt1regulatesinsulinsecretionbyrepressingucp2inpancreaticbetacells.plosbiol,2006,4:31.3junghynesb,nihalm,zhongw,etal.roleofsirtuinhistonedeacetylasesirt1inprostatecancer.atargetforprostatecancermanagementviaitsinhibition.jbiolchem,2009,284:38233832.4hiday,kuboy,muraok,etal.strongexpressionofalongevityrelatedprotein,sirt1,inbowen’sdisease.archdermatolres,2007,299:103106.5jangky,hwangsh,kwonks,etal.sirt1expressionisassociatedwithpoorprognosisofdiffuselargebcelllymphoma.amjsurgpathol,2008,32:15231531.6gaedckej,traubf,mildes,etal.predominanceofthebasaltypeandher2/neutypeinbrainmetastasisfrombreastcancer.modpathol,2007,20:864870.7chuf,choupm,zhengx,etal.controlofmultidrugresistancegenemdr1andcancerresistancetochemotherapybythelongevitygenesirt1.cancerres,2005,65:1018310187.8firesteinr,blanderg,michans,etal.thesirt1deacetylasesuppressesintestinaltumorigenesisandcoloncancergrowth.plosone,2008,3:2020.9wangrh,senguptak,lic,etal.impaireddnadamageresponse,genomeinstability,andtumorigenesisinsirt1mutantmice.cancercell,2008,14:312323.10luoj,nikolaevay,imais,etal.negativecontrolofp53bysir2alphapromotescellsurvivalunderstress.cell,2001,107:137148.11陳虹，王立東