大腸桿菌感受態(tài)細胞

關于大腸桿菌感受態(tài)細胞第一頁，共二十三頁，2022年，8月28日1.實驗目的和要求通過本實驗學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞和外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。第二頁，共二十三頁，2022年，8月28日2.相關知識及原理感受態(tài)細胞(Competentcells):受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competentcell)。

第三頁，共二十三頁，2022年，8月28日轉化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。

進入細胞的DNA分子通過復制表達，才能實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。第四頁，共二十三頁，2022年，8月28日轉化的方法：化學的方法(熱擊法)；使用化學試劑（如CaCl）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞；電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。第五頁，共二十三頁，2022年，8月28日克隆的篩選：主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；第六頁，共二十三頁，2022年，8月28日將經(jīng)過轉化后的細胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉化體，即帶有異源DNA分子的受體細胞。否則，如果將轉化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉化的質粒。雖然只有那些含有被轉化質粒的細菌才能在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對于連接混合物而言，此時并不能確定哪個克隆含有插入片段。第七頁，共二十三頁，2022年，8月28日重組質?？寺〉蔫b定鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有-互補、小規(guī)模制備質粒DNA進行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。最常用的方法是小規(guī)模制備質粒DNA進行酶切分析，對于帶有LacZ基因的載體還可以結合-互補現(xiàn)象來篩選。第八頁，共二十三頁，2022年，8月28日-互補現(xiàn)象：因為有些載體都帶有一個LacZ基因的調(diào)控序列和頭146個氨基酸的編碼信息，編碼-互補肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)互補（-互補）。當這種載體轉入可編碼－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所以稱這種現(xiàn)象為-互補現(xiàn)象。第九頁，共二十三頁，2022年，8月28日由互補產(chǎn)生的－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－半乳糖苷(X-gal)而產(chǎn)生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外源DNA片段時，會造成LacZ()基因的失活，破壞-互補作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重組質粒的菌落為藍色。第十頁，共二十三頁，2022年，8月28日第十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日重組DNA轉化細菌過程示意圖第十二頁，共二十三頁，2022年，8月28日3．儀器、材料和試劑無菌超凈臺，電熱恒溫水浴，分光光度計，離心機，移液器，微型離心管等；菌株：E.coliDH5α質粒：pBluscriptKS+DNA

片段的重組質粒以及pBluscriptKS

空質粒；LB培養(yǎng)基；含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐青霉素，濃度50-100μg／mL，X-gal20-48μg/ml,IPTG100μg/ml。一般將抗生素、X-gal和IPTG配制成1000儲備液，用時按培養(yǎng)基的量再加入）；預冷CaCl2溶液（0.1mol／L）第十三頁，共二十三頁，2022年，8月28日4．操作步驟

1）大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)（1）從新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長期。將該菌懸液以1:100～1:50轉接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時停止培養(yǎng)；第十四頁，共二十三頁，2022年，8月28日（2）每組取培養(yǎng)液3個2ml轉入2ml離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4℃，4000r／min離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進行，速度盡量快而穩(wěn)）；（3）倒凈上清培養(yǎng)液，用1ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴；（4）0～4℃，4000r／min離心10min；（5）棄去上清液，加入500μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細胞。0～4℃，4000r／min離心10min；第十五頁，共二十三頁，2022年，8月28日（6）棄去上清液，加入100μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細胞懸液；（7）制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉化實驗，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。第十六頁，共二十三頁，2022年，8月28日2）細胞轉化

(1)分別取3個100μl感受態(tài)細胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進行下面的操作)，第一組，加入10μl重組質粒DNA(體積不超過10μl)+100μl感受態(tài)細胞，此管為轉化實驗組。第二組，插入DNA片段對照組，即酶切后DNA片段25ng+100μl感受態(tài)細胞懸液；第三組，質粒DNA對照組，即1ng未酶切pBluescript質粒DNA十100μl感受態(tài)細胞懸液。第十七頁，共二十三頁，2022年，8月28日(2)將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保溫1－2min，然后迅速冰上冷卻2min(3)立即向上述管中分別加入0.4mlLB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉化反應原液，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min，使受體菌恢復正常生長狀態(tài)，并使轉化體表達抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)。第十八頁，共二十三頁，2022年，8月28日3)平板培養(yǎng)（有時需要稀釋）取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。第十九頁，共二十三頁，2022年，8月28日(2)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時)，待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng)，對于可以藍白斑篩選的質粒和菌株來說，此時應該能清楚地看到藍色和白色菌落。用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞，可使每微克超螺旋質粒DNA產(chǎn)生5106-2107個轉化菌落。在實際工作中，每微克有105以上的轉化菌落足以滿足一般的克隆實驗。第二十頁，共二十三頁，2022年，8月28日4)檢出轉化體和計算轉化率統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實驗組培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長狀況應如表所示:

第二十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日組含抗菌素的平板結果說明

轉化實驗組白