胖大海種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018胖大海種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了胖大海[SterculialychnophoraHance]種子超低溫保存過(guò)程中的術(shù)語(yǔ)和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于胖大海種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。胖大海SterculialychnophoraHance為梧桐科（Sterculiaceae）蘋婆屬（SterculiaLinn.）高大落葉喬木，又名大海子，因遇水膨大成海綿狀而得名。其干燥成熟種子入藥，味甘、性寒，具有清熱潤(rùn)肺、潤(rùn)腸通便的功效，用于肺熱聲啞，干咳無(wú)痰，咽喉干痛等。收載于《中國(guó)藥典（2015）》。胖大海果實(shí)SterculialychnophoraHancefruits果實(shí)橢圓形或圓形，附有船型果莢，果實(shí)未成熟時(shí)其果莢為紅色。胖大海種子SterculialychnophoraHanceseeds胖大海的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子表面棕色或暗棕色，微有XX，呈紡錘狀或橢圓形，長(zhǎng)2~3cm，直徑1~1.5cm，先端鈍圓，基部略尖，具有淺色的圓形種臍。具不規(guī)則的干縮皺紋，外層種皮極薄，質(zhì)脆，易脫落。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過(guò)前處理的胖大海種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實(shí)采收1月至3月，當(dāng)果莢顏色變?yōu)楹稚?，且果皮由青色變成褐色時(shí)即可采收。果熟時(shí)要及時(shí)\t"s://baike.so/doc/_blank"采收，否則種皮遇水容易膨脹發(fā)芽。去除果皮和雜質(zhì)，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過(guò)10天）。種子前處理生活力檢測(cè)參照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法檢測(cè)種子生活力。隨機(jī)抽取30粒種子，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，沿種脊小心將種子分成2爿后放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC溶液浸沒(méi)種子，室溫（25℃）避光放置4h后觀察染色結(jié)果。生活力計(jì)算直接用肉眼對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無(wú)生活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的胖大海種子生活力應(yīng)≥90%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹胖大海種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為700:1，室溫條件下干燥處理4~8h，在干燥過(guò)程中定期測(cè)定種子含水量，將種子含水量由70%~75%降至45%~50%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測(cè)定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量胖大海種子保存量不少于300粒，以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式胖大海種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的胖大海種子放入放入15mL凍存管（每管7~8粒種子）中，迅速投入液氮中保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出4個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min。凍后種子生活力檢測(cè)取出2管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測(cè)方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力≥65%時(shí)視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下2管解凍后的胖大海種子，播種到帶有無(wú)菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度25℃～30℃，濕度70%～85%條件下培養(yǎng)。附錄TTC的配制和保存方法精密稱取TTC1.00g，溶于100mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6.5~7.5，置棕色瓶?jī)?nèi)4℃冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氫鉀溶于1L無(wú)菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氫鈉溶于1L無(wú)菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液）參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].XX，中國(guó)醫(yī)藥科技出版，2010，245[2]VIETNAMGov.StrategyDevelopofNationalForestryfrom2010to2020andthevisionto2030.HanoiGovernment475QD-TTg.2010[3]傅家瑞，宋松