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文檔簡介
關于微生物學新技術在環(huán)境領域中的應用第一頁,共四十四頁,2022年,8月28日
固定化微生物,用制備固定化酶的方法將微生物固定在載體上,即成固定化微生物。固定化細胞比游離細胞穩(wěn)定性高,催化效率比離體酶高,且比固定化酶操作簡便,能完成多步酶反應。第二頁,共四十四頁,2022年,8月28日
二、酶的分離提純利用微生物生產(chǎn)酶制品可以分為菌種選育、發(fā)酵培養(yǎng)、分離提取和酶制品保存四個步驟。
1純化:●鹽析法,絕大多數(shù)情況采用(NH4)2SO4?!裼袡C溶劑沉淀法,乙醇或丙酮
●層析法,吸附層析法、離子交換層析法、分子篩過濾層析法、等電點沉淀法第三頁,共四十四頁,2022年,8月28日
三、固定化方法
固定化方法有載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法和逆膠束酶反應系統(tǒng)。第四頁,共四十四頁,2022年,8月28日第五頁,共四十四頁,2022年,8月28日1、載體結(jié)合法將酶固定在非水溶性載體上。載體有葡聚糖、活性碳、膠原、瓊脂糖、多孔玻璃珠、高嶺土、硅膠、氧化鋁、羧甲基纖維素等。
2、交聯(lián)法
利用雙功能試劑或多功能試劑使酶與酶發(fā)生交聯(lián)而進行固定。交聯(lián)劑有:戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺和六甲撐二異氰酸酯。第六頁,共四十四頁,2022年,8月28日
3、包埋法
將酶包埋在凝膠格子(格子型)中,或由半透性的聚合物膜組成的膠囊內(nèi)(微膠囊型)的方法。格子型的包埋材料:聚丙烯酰胺(PACAM)凝膠、聚乙烯醇(PVA)、瓊脂、硅膠等。微膠囊型的包埋材料:尼龍、乙基纖維素和硝酸纖維素
第七頁,共四十四頁,2022年,8月28日
4、逆膠束酶反應系統(tǒng)
表面活性劑的兩性分子在有機溶劑中自發(fā)形成聚集體,其親水一端連接成逆膠束的極性核,水分子插于核中,其疏水性的一端進入主體有機溶劑中,酶分子溶于逆膠束中,組成逆膠束酶系統(tǒng)。對微生物細胞的固定化最適合用凝膠包埋法。第八頁,共四十四頁,2022年,8月28日四、固定化酶和固定化微生物在環(huán)境工程中的應用
英國采用固定化細胞反應設備處理含氰廢水。中國應用固定化細胞技術降解含直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)廢水,去除率和酶活性保存率均在90%以上。德國將9種降解對硫磷農(nóng)藥的酶共價固定在多孔玻璃珠、硅膠珠上,制成酶柱處理對硫磷廢水,獲得95%以上的去除效果。第九頁,共四十四頁,2022年,8月28日
第二節(jié)微生物絮凝劑
傳統(tǒng)的絮凝劑有無機和有機高分子兩類,第三類為微生物絮凝劑。加量為200mg/L
一、微生物絮凝劑的特點
1、來源廣泛,生產(chǎn)周期短且效率高。
2、具很高的絮凝效果,與聚鐵、聚丙烯酰胺等絮凝劑比,絮凝速度大,沉淀易過濾。
3、對人體和動物無危害。
4、具可生化性,可防止絮凝后對環(huán)境造成的二次污染。
5、能廣泛應用于各種污水的處理。第十頁,共四十四頁,2022年,8月28日
二、微生物絮凝劑的結(jié)構(gòu)組成、化學本質(zhì)
1、微生物絮凝劑的結(jié)構(gòu)組成具有絮凝性的微生物涉及各類微生物,有細菌、放線菌、霉菌、酵母菌,原生動物等(表11-1)。微生物絮凝劑的組成和結(jié)構(gòu)見表11-2。
第十一頁,共四十四頁,2022年,8月28日第十二頁,共四十四頁,2022年,8月28日第十三頁,共四十四頁,2022年,8月28日
2、微生物絮凝劑的化學本質(zhì)微生物所產(chǎn)生的絮凝劑主要是微生物代謝過程中所產(chǎn)生的多聚糖類,有些是蛋白質(zhì)(或多肽),或者是含有蛋白質(zhì)(或多肽)。第十四頁,共四十四頁,2022年,8月28日三、微生物絮凝劑的絮凝機理
“橋聯(lián)作用”機理:絮凝劑大分子借助離子鍵、氫鍵和范德華力,同時吸附多個膠體顆粒,在顆粒之間產(chǎn)生“架橋”,從而形成一種網(wǎng)狀的三維結(jié)構(gòu)而沉淀下來。絮凝劑的分子結(jié)構(gòu)、形狀、相對分子質(zhì)量和所帶基團會影響其絮凝效果。第十五頁,共四十四頁,2022年,8月28日
四、微生物絮凝劑的合成和應用
1、微生物絮凝劑的合成一般認為,微生物多在其生長的中后期釋放絮凝劑形成絮體,但到了靜止期后期,細胞不再產(chǎn)生新的絮凝物質(zhì),甚至會由于出現(xiàn)解絮凝酶而導致絮凝活性下降。培養(yǎng)基的組成、初始pH、培養(yǎng)溫度、通氣狀況等會影響絮凝劑的合成。提取方法:凝膠色譜,有機溶劑提取和堿提取。第十六頁,共四十四頁,2022年,8月28日2、微生物絮凝劑的應用(1)高濃度有機水廢水的處理
NOC-1生物絮凝劑加Ca2+處理畜業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的廢水;C-62菌株產(chǎn)生的絮凝劑處理?革廢水。(2)染料廢水的脫色用于造紙黑液、糖蜜廢水、墨水廢水的脫色。第十七頁,共四十四頁,2022年,8月28日(3)乳化液油水分離用廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligenenslatus
)培養(yǎng)物易將棕櫚酸從其乳化液中分離出來。(4)活性污泥的處理從紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis
)分離得到的絮凝劑可促進污泥的沉降。第十八頁,共四十四頁,2022年,8月28日
第三節(jié)分子生物技術在環(huán)境領域中的應用
一、核酸探針和PCR技術
1、核酸探針在適當條件下,單鏈DNA片段能與另一段與之互補的單鏈片段結(jié)合,這個過程稱為核酸雜交。利用這一特性,將最初的DNA片段進行標記,即可做成核酸探針。
利用核酸探針技術可以檢測環(huán)境中是否存在某些特定種類的微生物,如致病菌和病毒。第十九頁,共四十四頁,2022年,8月28日2、PCR技術
PCR(Polymerasechainreaction)稱為DNA多聚酶鏈式反應,是對特異性DNA片段在體外進行擴增的一種非常快速而簡便的方法。(1)PCR的原理:第二十頁,共四十四頁,2022年,8月28日第二十一頁,共四十四頁,2022年,8月28日
(2)PCR技術的操作方法:①加熱變性將待擴增的DNA置于94~95℃的高溫中加熱5min,使雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA,分開的兩條單鏈DNA作為擴增的模板。②退火將加熱變性的單鏈DNA溶液的溫度緩慢下降至55℃后,在這過程中引物的DNA的堿基將與單鏈模板DNA一端堿基配對。
第二十二頁,共四十四頁,2022年,8月28日
③延伸退火之后,當溫度上升至72℃時,在耐熱性TaqDNA多聚酶、適當?shù)腜H和一定的離子強度下,寡核苷酸引物(引物DNA)堿基延伸和模板DNA結(jié)合構(gòu)成雙鏈DNA。經(jīng)過25~30次循環(huán),擴增倍數(shù)達106,可將2kb的DNA由原來的1pg擴增到0.5~1μg。第二十三頁,共四十四頁,2022年,8月28日第二十四頁,共四十四頁,2022年,8月28日(3)PCR技術的應用①應用PCR技術研究特定環(huán)境中微生物區(qū)系的組成、結(jié)構(gòu),分析種群動態(tài)。②應用PCR技術監(jiān)測環(huán)境中特定的微生物。③量化環(huán)境系統(tǒng)中微生物群體的各組成成員。
第二十五頁,共四十四頁,2022年,8月28日
二、16SrDNA序列及其同源性的分析
通過對16SrRNA基因的DNA序列分析,可以分析細菌的種類信息,并且已經(jīng)逐漸成為微生物分類和鑒定中非常重要而且有用的指標和手段。第二十六頁,共四十四頁,2022年,8月28日
16srRNA基因技術在環(huán)境科學領域中的應用
①鑒定生物降解菌;②研究某一特定環(huán)境中微生物的區(qū)系組成,進而了解其種群動態(tài),研究微生物的多樣性。
PCR-DGGE或PCR-TGGE分析微生物的多樣性第二十七頁,共四十四頁,2022年,8月28日變性梯度凝膠電泳DGGE1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于檢測DNA片段中的點突變的一種電泳技術。
Muyzer等人在1993年首次將其應用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。后來又發(fā)展出其衍生技術,溫度梯度凝膠電泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)。第二十八頁,共四十四頁,2022年,8月28日原理雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時,其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區(qū)分開,但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣,不能被區(qū)分。DGGE/TGGE技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上,加入了變性劑(尿素和甲酰胺)梯度或是溫度梯度,從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區(qū)分開來。一個特定的DNA片段有其特有的序列組成,其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(meltingdomain,MD)和解鏈行為(meltingbehavior)。一個幾百個堿基對的DNA片段一般有幾個解鏈區(qū)域,每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。第二十九頁,共四十四頁,2022年,8月28日顯示的是一個234bp長的DNA片段的解鏈區(qū)域,橫坐標是該DNA片段的序列,依次從第一個堿基到第234個堿基;縱坐標是解鏈溫度。該DNA片段共有3個解鏈區(qū)域。MD1是解鏈溫度最低的一個解鏈區(qū)域,MD3是溫度最高的一個解鏈區(qū)域。第三十頁,共四十四頁,2022年,8月28日不同的雙鏈DNA片段因為其序列組成不一樣,所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當它們進行DGGE時,一開始變性劑濃度比較小,不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈,此時DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。一旦DNA片段遷移到一定位置,其變性劑濃度使雙鏈DNA片段最低的解鏈區(qū)域解鏈,部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此,不同的DNA片段會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導致遷移速率大大下降,從而在膠中被區(qū)分開來。第三十一頁,共四十四頁,2022年,8月28日然而,當變性劑濃度達到DNA片段最高的解鏈區(qū)域溫度時,DNA片段會完全解鏈,此時它們又能在膠中繼續(xù)遷移,這些片段就不能被區(qū)分開來。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段(GC夾子,一般30-50個堿基對)可以解決這個問題。含有GC夾子的DNA片段解鏈溫度很高,可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當加了GC夾子后,DNA片段中每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。第三十二頁,共四十四頁,2022年,8月28日第三十三頁,共四十四頁,2022年,8月28日當用DGGE/TGGE技術來研究微生物群落結(jié)構(gòu)時,要結(jié)合PCR(polymerasechainreaction)擴增技術,用PCR擴增的16SrDNA產(chǎn)物來反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成。通常根據(jù)16SrRNA基因中比較保守的堿基序列設計通用引物,其中一個引物的5’-端含有一段GC夾子,用來擴增微生物群落基因組總DNA,擴增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析500bp以下的DNA片斷,所以一般選擇擴增16SrRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。第三十四頁,共四十四頁,2022年,8月28日16SrDNA的高可變區(qū)E.coli16SrRNA二級結(jié)構(gòu)及各可變區(qū)
V3區(qū)約170bpV6-V8區(qū)約350bp
片段大小不同,攜帶的信息量不同,選擇不同的區(qū)域得到DGGE圖譜不同,群落信息也有差異不同的片段大小對應的膠濃度也不同根據(jù)需要選擇最合適的提取基因組后,擴增16SrDNA高可變區(qū)片段第三十五頁,共四十四頁,2022年,8月28日確定合適的變性劑范圍對DNA片段進行有效分離根據(jù)變性劑梯度方向與電泳方向相同或不同,DGGE分為:垂直DGGE平行DGGE第三十六頁,共四十四頁,2022年,8月28日常規(guī)的DGGE電泳技術對于長度超過500bp的DNA片段的序列變化情況,只能有50%的檢出率。
應用“GC夾板”技術可使檢出率提高到100%。
當?shù)乳L的雙鏈DNA分子在含梯度變性劑(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時,因其解鏈的速度和程度與其序列密切相關;部分解鏈的DNA分子的遷移速度隨解鏈程度增大而減小。GC-Clamp16SrDNA低濃度高濃度第三十七頁,共四十四頁,2022年,8月28日DGGE的參數(shù):
膠濃度
取決于片段大小,通常不宜超過500bp6%膠濃度:400~1000bp8
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