采用Agilent 1200系列液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行藥物雜質(zhì)分析

采用Agilent1200系列液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行藥物雜質(zhì)分析概述引言在日常質(zhì)量控制和質(zhì)量保證工作中，藥物中的雜質(zhì)分析從初步篩選開始，以使用認(rèn)證方法結(jié)束。在藥物價(jià)值傳遞鏈上，藥物雜質(zhì)分析日益成為了一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。本匯編就高分離度快速液相色譜(RRLC)與質(zhì)譜聯(lián)用如何用于藥物中雜質(zhì)分析和定性提供一個(gè)指南，以提高您的工作效率。綜述了安捷倫最近的一些有關(guān)藥物中雜質(zhì)分析的應(yīng)用文摘。這些文摘以詳細(xì)摘要的形式介紹，若需深入閱讀全文，您可以從下面的網(wǎng)站下載：/chem/library。藥物中的雜質(zhì)通常，從兩個(gè)方面關(guān)注藥物中的雜質(zhì)：-化學(xué)方面包括對(duì)雜質(zhì)的種類和鑒定，涉及到如何生成報(bào)告、如何設(shè)定適當(dāng)?shù)闹笜?biāo)，以及描述分析步驟。-更重要的是病人的安全方面，當(dāng)新藥上市時(shí)，這些病人將要使用最終產(chǎn)品。在這方面，比較研究和基因毒性測(cè)試變得越來越重要。從法規(guī)機(jī)構(gòu)如美國食品和藥品管理局(FDA)和EMEA等的觀點(diǎn)看，藥物中的雜質(zhì)分成以下幾類：-有機(jī)雜質(zhì)(與工藝和藥物相關(guān))-無機(jī)雜質(zhì)-殘留溶劑本匯編提供的應(yīng)用文摘系列"使用Agilent1200系列液相色譜系統(tǒng)分析雜質(zhì)”主要討論有機(jī)雜質(zhì)：-第一部分：采用LC/MS鑒定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)(5989-5617EN)-第二部分：采用制備HPLC分離雜質(zhì)(5989-5618EN)-第三部分：為方法開發(fā)快速確定分析條件(5989-5619EN)-第四部分：超快速方法的方法認(rèn)證(5989-5620EN)-第五部分：附有完整步驟的QA/QC應(yīng)用舉例(5989-5621EN)在第15頁的附錄中有詳細(xì)的無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑文獻(xiàn).示例研究本匯編中有5個(gè)應(yīng)用文摘說明了在藥物開發(fā)和商品化過程中典型分析方法開發(fā)和QA/QC實(shí)驗(yàn)室的分析流程，即，在藥物活性成分中分析測(cè)定與生產(chǎn)有關(guān)的雜質(zhì)。在研究的初期，采用高分離度快速液相色譜，通過加快分析速度，并與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用，提供準(zhǔn)確的質(zhì)量信息，這就大大改進(jìn)了分析過程。有機(jī)雜質(zhì)來源有多種、濃度各不相同，它們最可能來源于藥物活性物質(zhì)的合成和儲(chǔ)存過程，也可能來自最終藥物產(chǎn)品的制造工藝和/或儲(chǔ)存過程，可能來自于：?起始原材料?副產(chǎn)物?中間體?降解產(chǎn)物?試劑和配體，也有來自包裝材料的。根據(jù)FDA的指南“藥物中的雜質(zhì)”，含量低于0.1%的雜質(zhì)一般不必進(jìn)行鑒定。然而，對(duì)于那些可能有異常作用、0.1%以下濃度也可產(chǎn)生毒性或藥理作用的潛在雜質(zhì)就應(yīng)當(dāng)進(jìn)行鑒定。在所有情況下，雜質(zhì)都應(yīng)該定性。雖然現(xiàn)實(shí)中一般把0.05%到0.09%的分析結(jié)果取近似值(即0.1%)，但本指南的目的，在確定是否對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行鑒定時(shí)，這樣的值不應(yīng)當(dāng)近似為0.1%。總之：為了減少潛在的副作用，需要對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行靈敏的測(cè)定，而飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜能夠提供高靈敏度測(cè)定和準(zhǔn)確質(zhì)量鑒定，是鑒定痕量雜質(zhì)的首選方法。副產(chǎn)物分析本出版物介紹的分析步驟主要涉及原料、副產(chǎn)物和中間體的分析，以及如何在鑒定過程中及早有效地檢測(cè)它們。關(guān)于包裝材料和有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)(OVI)分析的詳細(xì)說明可參看附錄。雜質(zhì)分析遵循典型的方法開發(fā)流程，方法優(yōu)化/轉(zhuǎn)移以及最后在GMP條件(圖1)下常規(guī)使用。安捷倫科技長期以來致力于為制藥行業(yè)的分析化學(xué)家提供合適的儀器，以持續(xù)提高分析速度，并實(shí)現(xiàn)更高靈敏度的藥物分析。我們希望這個(gè)匯編是有用的，能夠提供保證病人安全的方法。1.采用LC/MS鑒定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)引言在現(xiàn)代制藥業(yè)、藥物開發(fā)和制造中，準(zhǔn)確地鑒定微量雜質(zhì)和副產(chǎn)物是極端重要的，因?yàn)殡s質(zhì)和副產(chǎn)物可能對(duì)人體有潛在的毒性。在藥物研發(fā)的各個(gè)階段分析雜質(zhì)是非常重要的，而且是整個(gè)工藝的瓶頸。例如，本應(yīng)用文摘討論了用高分離度快速液相色譜離壬阱和電噴霧oaTOF質(zhì)譜鑒定藥物合成過程中的副產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)儀器Agilent1200系列高分離度快速液相系統(tǒng)(RRLC)，Agilent6210飛行時(shí)間質(zhì)譜Agilent6330離子阱質(zhì)譜

方法?色酒柱」 ZOREAXSBC182.1x150mm270nm±4nm?MS-TOF:離子如制度"00'C.*溶機(jī)A:?K參比360±8nni正離子模式-B:乙膈各含QI%峰寬0.】m]np干燎氣t12Uniln.三R^(ACN),進(jìn)偉器*】pL進(jìn)樣量，用甲客化氣：如閔,流最0.5mL/mln醇水（1啪機(jī)秒排孔140V.拂度1*0mln-5%&?柱箱溫度&60^曰描m/z100-100。.30mln95%B,,儺離子阱:離子源混盅:瀾筆參比魔量溶液開啟,32min95%B.正離子模式.停止時(shí)間：32mln干燥氣*lOL/n^n,Posttime:10mln.零比氣t40psL>DAD:而通他’ICC:125DOO,10mm光％B.^rMS^lSftMS3結(jié)果與討論Bramanisoe合成的主要產(chǎn)物是藥物和其非對(duì)映異構(gòu)體，微量雜質(zhì)ABramanisoe合成的主要產(chǎn)物是藥物和其非對(duì)映異構(gòu)體，微量雜質(zhì)A（圖1）。其它的可能雜質(zhì)是降解產(chǎn)品（雜質(zhì)B,C和D）以及合成的離析物（雜質(zhì)E和F）。要在一個(gè)藥物化合物中發(fā)現(xiàn)所有可能的雜質(zhì)，很重要的一點(diǎn)是使用幾種正交的分離技術(shù)，比如液相色譜、氣相色譜或薄層色譜。僅用LC/UV分析，合成中使用的離析物與它們的保留時(shí)間對(duì)比證明雜質(zhì)F是3-bromanisole(圖1)。離析物雜質(zhì)E用UV和ESI-MS都沒有檢測(cè)到。所以，又用GC-FLD分析了樣品，可以檢測(cè)到該化合物，并通過保留時(shí)間比較得到了證實(shí)(數(shù)據(jù)略)。為證實(shí)所有雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了LC/MS-TOF分析，以測(cè)定準(zhǔn)確的分子量并計(jì)算經(jīng)驗(yàn)分子式。該實(shí)驗(yàn)可在低ppm下，以足夠準(zhǔn)確的質(zhì)量確證所有建議的分子式。要獲得有關(guān)雜質(zhì)更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，就要進(jìn)行離子阱質(zhì)譜分析(圖2)。非對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)(A)在保留時(shí)間8.20min檢測(cè)到，質(zhì)量數(shù)為m/z264.1。這一化合物的分子離子在MS/MS碎裂時(shí)由于失去水而產(chǎn)生碎片離子m/z246.1；在三級(jí)質(zhì)譜(MS3)解離時(shí)，離子m/z246.1由于失去甲氧基而產(chǎn)生主要離子m/z215.1；失去甲基氨基產(chǎn)生離子m/z202.1，以及與芐基陽離子相關(guān)的碎片離子m/z121.1。SDoooD^50520SDoooD^50520752分子式Et誰啪板A264.1964264.195?-0.72.5B%頊0246.1858246.1850-0.93.2C烏乩NQ246.1S58#6.1951-0.72.9□京板N魚250.16072ffl.190d-0.31.2atLCTTOf分斯H定泉廊的曜第質(zhì)井司過甘鼻艷時(shí)質(zhì)■誠卷證虞融分子式用制SA眄高子陣MS.分子H子顧&4土日嶂IS峰MS/MS辟片寓子.m/2246.1.C)m/z24(.11子的結(jié)論我們論述了使用Agilent1200系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，1.8-頃的RRHT色譜柱，并與Agilent6330離子阱和Agilent6210ESITOF質(zhì)譜聯(lián)用來對(duì)藥物的微量雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定。采用1200系列RRLC系統(tǒng)，在1.8-pm色譜柱上實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)所有雜質(zhì)需要的分離度。離子阱串聯(lián)MS/MS和MSn，可用于結(jié)構(gòu)鑒定，ESI-TOF通過準(zhǔn)確測(cè)定質(zhì)量可用于初步分子式的確證。2.使用制備HPLC分離雜質(zhì)引言雜質(zhì)分析是一系列分析活動(dòng)，目的是對(duì)藥物中的有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)、鑒定、結(jié)構(gòu)解析和定量測(cè)定"這一過程的第一個(gè)任務(wù)是檢測(cè)所有雜質(zhì)，為此要使用各種正交分析技術(shù)，如氣相色譜，毛細(xì)管電泳和高壓液相色譜，包括聯(lián)用的MS技術(shù)，如離子阱和飛行時(shí)間（TOF）質(zhì)譜。然而，即使采用最先進(jìn)的質(zhì)譜系統(tǒng)，解析所有化合物的結(jié)構(gòu)也常常是不可能的。這些化合物必須分離和純化，然后用1H-和13C-NMR進(jìn)行表征。這里介紹了一對(duì)用MS不能鑒定的化合物的分離和純化。結(jié)果與討論如Agilent應(yīng)用文摘2中所述，采用離子阱和飛行時(shí)間質(zhì)譜可以鑒定兩種雜質(zhì)（A和D）。然而，另外兩種雜質(zhì)（B和C）卻不能完全鑒定，所以采用制備HPLC進(jìn)行分離以便實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定。分析方法2是針對(duì)雜質(zhì)B和C的分離度以及較短的分離時(shí)間而優(yōu)化的。方法放大之前，采用分析柱進(jìn)行了上樣實(shí)驗(yàn)。1.0444mg原樣注射到ZORBAXSB-C18色譜柱上（4.6x150mm,5心仍然可以實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)B和C的基線分離。放大計(jì)算在富集的樣品中，雜質(zhì)B和C的濃度約為主要化合物的3-5%，也就是說，在分析柱上每次進(jìn)樣只可分離每種雜質(zhì)約0.03-0.05mg。因此，將分離放大到21.2mm內(nèi)徑的制備柱上，粗樣上樣量約22mg，每次進(jìn)樣可分離每種雜質(zhì)約0.66-1.1mg。這樣，不用十次進(jìn)樣就能得到足以進(jìn)行NMR分析的樣品量。純化參數(shù)使用化學(xué)工作站的FractionPreview功能優(yōu)化餾分收集參數(shù)。調(diào)用一個(gè)制備運(yùn)行的色譜圖，調(diào)節(jié)餾分收集參數(shù)，如閾值（threshold）、上行斜率（upslope）、下行斜率（downslope）和上限閾值（upperthreshold）等3，直到實(shí)現(xiàn)預(yù)期收集效果。在此情況下，時(shí)間窗口（9-14秒）內(nèi)只基于閾值的收集就給出了最佳結(jié)果。圖1顯示了使用FractionPreview優(yōu)化參數(shù)得到的實(shí)際餾分收集運(yùn)行結(jié)果。將十次連續(xù)純化運(yùn)行收集的雜質(zhì)合并，雜質(zhì)C（純度98.7%）和雜質(zhì)B（純度98.2%）的量就足以用NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析（圖2）。C|：99.7%)min藥制曾或中馨定主擊分中的柬C|：99.7%)min藥制曾或中馨定主擊分中的柬JSmAUCH.7%)、mAU結(jié)論從Agilent1200系列RRLC系統(tǒng)上開發(fā)的高分離度分析方法開始，說明了兩種雜質(zhì)的分離和純化。方法轉(zhuǎn)移到從Agilent1200系列LC系統(tǒng)和從Agilent1200系列制備系統(tǒng)是非常方便的，因?yàn)閺腁gilent的固定相既有用于分析柱的亞2微米的填料，也有用于制備柱的標(biāo)準(zhǔn)5-pm填料。所以，方法優(yōu)化和上樣實(shí)驗(yàn)之后的制備放大可以直接完成，而不必在制備柱上進(jìn)一步優(yōu)化方法?；瘜W(xué)工作站的功能，如FractionPreview和餾分自動(dòng)收集很容易在短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳純化。收集餾分的高純度和回收率使得雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定成了一件很容易的工作?？焖俸Y選方法開發(fā)的條件引言“開發(fā)和認(rèn)證新的分析方法成本高且費(fèi)時(shí)”1所以，任何可減少單次分析運(yùn)行時(shí)間的措施對(duì)整個(gè)分析過程都是有利的，但絕不能損失分離度、靈敏度、特別是可靠性。Agilent提供亞2微米填料粒徑度的色譜柱，以及1000倍以上使用壽命的高質(zhì)量，這使得方法開發(fā)過程大為加快。開始時(shí)，常常要確定較寬的分離條件范圍，如固定相、流動(dòng)相參數(shù)(％B,緩沖液，pH，溶劑)和操作參數(shù)如梯度陡度、溫度等等，以確定最佳初始條件，然后進(jìn)行微調(diào)。本應(yīng)用文摘討論了使用Agilent1200高分離度快速液相色譜(RRLC)系統(tǒng)和各種AgilentZORBAXRRHT色譜柱來確定每次分析不超過4min的分離條件，以及分離位置異構(gòu)體化合物和非對(duì)映異構(gòu)體的分離效率。實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)均在Agilent1200系列RRLC系統(tǒng)上完成，配置有SL型二元泵，溫控高效SL型自動(dòng)進(jìn)樣器，SL型柱恒溫箱和SL型二極管陣列檢測(cè)器。在條件篩選過程中，測(cè)試了16種不同的條件。下列AgilentZORBAX色譜柱用作固定相：StableBondCN,StableBondC18,ExtendC18,EclipseXDBC8和EclipseXDBC18。流動(dòng)相是HPLC級(jí)水和甲醇或乙腈，以及不同的添加劑。酸度條件為：0.2%TFA(強(qiáng)溶劑為0.16%)，pH1.92，弱酸條件是磷酸緩沖液，pH=6.02，最終的堿性條件是：0.2%氨(pH=11.0)。色譜柱、流動(dòng)相和pH的所有可能組合中，只試驗(yàn)了合理的組合。初始篩選采用3.0mmIDx50mm的色譜柱、低延遲體積的泵配置和5(L/6mm流通池的DAD。選擇一支4.6-mmID的色譜柱進(jìn)行方法微調(diào)，使用標(biāo)準(zhǔn)延遲體積的泵配置和13(L/10mm的檢測(cè)器流通池。所有篩選試驗(yàn)采用梯度為5-95%B，溫度40^。更詳細(xì)的情況請(qǐng)參閱第10頁的參考文獻(xiàn)2。結(jié)果與討論ExtendC1B.ZB.pH=11.0ExtendC1B.ZB.pH=11.0本方法開發(fā)的目的是提供一個(gè)快速而耐用的方法，用于藥物生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的定量，藥物為堿性鹽，pKa9.4,易溶于水。從前面的實(shí)驗(yàn)我們知道，采用其它技術(shù)如GC或TLC，而不是HPLC，就可以很容易地檢測(cè)到反應(yīng)試劑。故將關(guān)注點(diǎn)放在非對(duì)映異構(gòu)體A和區(qū)域去羥基化產(chǎn)物B和C、以及去甲基化產(chǎn)物D的分離上（見圖2的分子結(jié)構(gòu)）。在初期條件篩選過程中，使用富集了雜質(zhì)的樣品，對(duì)于不同的固定相和流動(dòng)相組合采用了5-95%B的寬范圍梯度。正如所料，改變流動(dòng)相和/或固定相，選擇性就發(fā)生變化，對(duì)色譜分離結(jié)果有顯著的影響。選擇了錯(cuò)誤的條件可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論：樣品是很簡單的混合物。其它條件顯示有4個(gè)峰，最后的條件5個(gè)化合物都檢測(cè)到了。圖1給出了顯示選擇性變化作用的實(shí)例。在選擇微調(diào)的最佳初始條件進(jìn)行微調(diào)時(shí)，只考慮分離度小于2的難分離物質(zhì)對(duì)不超過1對(duì)的條件。最后，選擇了StableBondC18色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。微調(diào)首先將條件轉(zhuǎn)移到一支4.6mmID的色譜柱上，這樣的柱內(nèi)徑是制造業(yè)QA/QC環(huán)境優(yōu)選的。然后，將梯度范圍變窄，還研究了溫度對(duì)微調(diào)方法的影響。最終方法對(duì)所有混合物可以得到大于3的分離度（圖2）。表1列出了分離含有低濃度（主成分的0.05%）雜質(zhì)的樣品的某些特征值。如參考文獻(xiàn)3和4所述，開發(fā)的方法能滿足標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證程序以及在制藥QA/QC條件下應(yīng)用的所有要求。

DAcE質(zhì)_頑一備一而案寇主弱暴艱蒿最埠方法親忤用于含仕漆度來里［主成分的烈＞5魅】的嵯品分折--DAcE質(zhì)_頑一備一而案寇主弱暴艱蒿最埠方法親忤用于含仕漆度來里［主成分的烈＞5魅】的嵯品分折--法?■>rM-?終利屋理虞■fTtm流理?偉止時(shí)4Posttime：DAD：進(jìn)硅Uh講肆圈:4=亦(M2%TFA).日=乙曲.舍0.16虬年秋百令HTFA)如X2.2mUhiin0.00min 17%B2.00niin 45%B100min 45%B3.00niin1J00niin光ifi 190-500nm臨寬1nEL果搓所萄光謂信號(hào)A: 270uni<8nm),參比.500nmtlOOnm)排需： >0.03min〔響應(yīng)時(shí)司口.晝)蜘 Qnnin： 運(yùn)行前6liL距薔秋點(diǎn)LAWlDs仰尊)彗面痢神U.5］崎有fmAUl 密輯百升比含■［(!■39936腐#舶.39.51ci1122-0.250.1901.300.050%1.7615%0.230.1501.390.016%1.623.21497.10222.3002.1199.791始3492.6919.830.310.2201.360.066%2.323.590.230.1701.270.0^6%1.62SJitWftSi*;圭成分卿力$%：?欒原的株品豹*魚制EH結(jié)論使用Agilent1200系列RRLC系統(tǒng)和亞2微米粒徑填料的色譜柱進(jìn)行條件篩選和微調(diào)可以減少活性藥物組分中難分離的非對(duì)映異構(gòu)體和位置異構(gòu)體雜質(zhì)的方法開發(fā)時(shí)間。由于需要很短的篩選運(yùn)行周期(4.5min)，一天之內(nèi)可以試驗(yàn)很多組條件(包括重復(fù)和空白運(yùn)行)。其它的微調(diào)再用半天時(shí)間，所以，一天半之后就可提供一個(gè)方法用于后續(xù)的方法認(rèn)證，由于采用最終方法每次單個(gè)運(yùn)行的時(shí)間只有4min，因此也會(huì)明顯減少方法認(rèn)證的時(shí)間?？焖貺C方法的方法認(rèn)證引言

為了保證分析結(jié)果符合法規(guī)要求，在滿足法規(guī)依從性的分析實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)他們的方法進(jìn)行認(rèn)證。此外，盡管他們使用不同的儀器。不同實(shí)驗(yàn)室的不同用戶所得結(jié)果應(yīng)是可比的，所以，方法必須盡可能穩(wěn)定可靠，以對(duì)誤差進(jìn)行補(bǔ)償，因?yàn)椴煌挠脩粼谙嗤虿煌膬x器上運(yùn)行相同的分析時(shí)可能產(chǎn)生誤差。這里介紹的認(rèn)證程序是基于美國藥典(USP)，ICH指南Q2BL2以及FDA指南的要求4,5，這些要求為世界各國所認(rèn)可，并被制藥、食品、環(huán)境和化工分析實(shí)驗(yàn)室所采用。下面介紹分析一個(gè)主成分及其4個(gè)雜質(zhì)的快速LC方法的認(rèn)證，圖1給出了典型色譜圖。毗-個(gè)生成分it其4個(gè)親反豹分折.生成乎1,15啊砌親B6為主液分咖用應(yīng)％認(rèn)證程序在預(yù)認(rèn)證實(shí)驗(yàn)之后，設(shè)置了表1所列的認(rèn)證協(xié)議。測(cè)試并給出了專屬性3。沒有采取進(jìn)一步的樣品制備步驟。稱取樣品化合物并溶于水。設(shè)定了組成的限量并與實(shí)測(cè)值比較以確定通過或失敗(表2)。雜質(zhì)的分析結(jié)果列于表3。1,王莊分布常而秋切俁卵時(shí)度6個(gè)淀.度，每個(gè)更度茜」司次L王卮務(wù)的坦謊員研，度,督中站度3.王成分的我蘭6^0.每個(gè)誼愛茜」司炭4王反分的M正散菠晚苗淮3次注樣5.王成糊幃6.奈原玷麓面或疝榻哥時(shí)承蠣1命淀邕督中話度訪日也這7.柬質(zhì)n與誠度T個(gè)證度，每個(gè)姑麾茜」司炭a.■個(gè)錠度.每個(gè)iS度場(chǎng)日罰次9.親原的宛國10.停瀏犀和定量瞿11.主成分和系底的可攔不司的在泥至，宏律!t.TF.4戢加一槨依步長、溫長.用戶和陞爵，沒有蝕社用性割詁膏試卷教拆準(zhǔn)痛集潮律值1嶺固羯f呆*面積<0.5%red通過削二間耳度RT<0.1%rsdRT<0.1%r5d2近精質(zhì)±1.5界3域性>0.99990>0.99999通過乓由目子曬叵園子5矣葩閉新5%藥割向A記更敗應(yīng)-0.01%-0.01%理耳5瓣|2310.08mg/rnL2.Sf10.073nig.inL酒痘11巡牲<2%nd.峰百*<2%r^d.嶂面枳誡E*2.圭漁什的測(cè)故蜻旻刮試婭株準(zhǔn)摑標(biāo)iliV制ft6釁W段利席雄互積￡5無「3dR言用吠3%nd詭過^.$0.05%W.05%RT<D.5%片。RT<D.16%r5d7準(zhǔn)胴度±5%建成度口.口5%±3%曲過9姓性>0.9990>0.9999肩應(yīng)因子也應(yīng)目子通過3毛扯珂苗9葩南0.0^10.3pg;mL0.02B7到叫皿歸'niL通過10栓割限瞬1防LQD0.01%le^lLCD0.007i%itLOQ0.03SIpvpILOQ0.027%lwel11M用性<10%「5d時(shí)于時(shí)至枳0.07泗svp|0.07%leva結(jié)論為分析主成分和4種雜質(zhì)開發(fā)了快速LC方法。該方法的認(rèn)證是成功的，滿足了涉及精度、線性、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定可靠性的所有要求。這說明快速LC方法可以用于QA/QC實(shí)驗(yàn)室，且符合USP/ICH推薦的要求?？焖貺C方法提供了同樣的數(shù)據(jù)質(zhì)量，而且又有較高的樣品通量。QA/QC應(yīng)用舉例，采用快速LC方法實(shí)現(xiàn)高通量樣品分析引言已經(jīng)開發(fā)了一個(gè)快速分析LC方法，在對(duì)這一快速分析方法認(rèn)證之后，下一步就是將這一方法轉(zhuǎn)移到QA/QC實(shí)驗(yàn)室。通常，詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)保證分析過程中出錯(cuò)和誤解的幾率盡可能小。下面是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的例子，包括系統(tǒng)適用性測(cè)試、序列和結(jié)果通過認(rèn)證的指標(biāo)。Agilent1200系列高分離度快速液相色譜(RRLC)系統(tǒng)用來進(jìn)行序列分析、系統(tǒng)適用性檢測(cè)報(bào)告、樣品和校準(zhǔn)混合物的分析。色譜條件是基于以前的應(yīng)用文摘所開發(fā)認(rèn)證的LC方法，參見文獻(xiàn)1和2。約5min的樣品分析周期應(yīng)當(dāng)大大提高了樣品通量，進(jìn)而降低了分析成本。下面是簡化的SOP舉例，并給出了結(jié)果舉例。性能測(cè)試要確定一個(gè)樣品是通過還是失敗需要多次測(cè)試。必須使用校準(zhǔn)混合物和對(duì)照樣品，以及含有用來稀釋樣品的溶劑的空白樣品。表1概要列出了測(cè)定樣品分析的精度、靈敏度、分離度和其他性能參數(shù)的要求?；谠摫矶x的要求，在安捷倫化學(xué)工作站軟件中設(shè)置了一個(gè)分析序列表(表2)。這個(gè)序列的開始是適用性測(cè)試樣品，在3個(gè)樣品和一個(gè)對(duì)照樣品分析之前和之后是校準(zhǔn)運(yùn)行，在這些運(yùn)行之間要注射純水樣品以保證沒有記憶效應(yīng)或鬼峰，因?yàn)檫@些會(huì)干擾下一次分析。樣品昌的空白落液君遷基盟電定性理口次.衛(wèi)括左;土彳；并柴定甚苑繩所廠也w品3遷靈敏鼠即分再度1校推沮今宜飪庖立忙程度性33遷花立的程度性井袒正點(diǎn)徑混合汗13系境導(dǎo)芾K品分"yk.和瘧崎比的精度6雜而有主成ii■此定0并/定釁百程拓保留時(shí)司3衰1維樣昌贏過或蠅敗所需的測(cè)艮RSOI由時(shí)間）RSDrun)kSJNA49|jg;niL0.1420.1559.明0.018min11.4375J4.S陽'inL0.0620.4633.890.019min21.9579.35.1pj'niL0.0690.3996.760.019min20.09109.74,4田'eL0.2460.2010.019minB.6T79.99.99pg^niL0.10?0.1606.1JO.OIBmin1109109.7系埃培期性捐試靖果測(cè)試結(jié)果舉例作為一個(gè)例子，我們介紹系統(tǒng)適用性測(cè)試規(guī)程。要測(cè)試系統(tǒng)是否滿足方法要求，制備了主成分和雜質(zhì)A、B、C、D的溶液，濃度為4-10pg/mLo每天第一次進(jìn)樣之前都要分析這個(gè)溶液。測(cè)試的參數(shù)和極限值設(shè)置：-峰面積的精度必須＜2%rsd-保留時(shí)間的精度必須＜0.5%rsd-所有峰的分離度必須〉2?最大的半峰寬必須＜0.08min?k'必須5＜k'＜25?所有峰的信噪比必須〉50系統(tǒng)適用性樣品的測(cè)試結(jié)果列于表2。滿足了所有的極限指標(biāo)。以同樣的方法，評(píng)價(jià)了校準(zhǔn)標(biāo)樣和對(duì)照樣品的參數(shù)指標(biāo)。所有測(cè)試都滿足了極限指標(biāo)，被分析樣品也通過了極限指標(biāo)，3個(gè)樣品的雜質(zhì)含量均沒有超過0.5%的允許極限值。結(jié)論分析QA/QC部門面臨著分析樣品數(shù)量的逐漸增多以及對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量和可靠性越來越高的要求。一般來說，為保證定性和定量數(shù)據(jù)的正確性，一個(gè)樣品需要運(yùn)行10-15次。本文完整地認(rèn)證的快速LC方法有助于顯著提高樣品分析通量，而不損失數(shù)據(jù)的質(zhì)量。所用序列包含47次分析運(yùn)行，包括30min的系統(tǒng)適用性測(cè)試，共用3.9小時(shí)。若使用一個(gè)樣品分析周期為20min左右的方法，大致需要15.7小時(shí)。這說明快速LC方法明顯提高了樣品通量。溶劑的節(jié)省也非常明顯。采用20min的樣品分析周期，47次運(yùn)行，流速為2.2mL/min，需要溶劑2068mL。而采用本文的快速LC方法，5min的樣品分析周期，47次運(yùn)行只需要517mL溶劑。每次分析的成本因而也大大下降為大約原來的1/5~1/4。見表3的舉例。&mm樣品分折胃期262091046^督*分祈文故成本$1低(2.95擔(dān)10叩次分后大垃成rS11.36012.850督m叩次務(wù)折節(jié)由成五13.500儲(chǔ)便用快色LC方法增前豹樣昌謫*和育物的什祈成本/孫射/乳7S/1.521/*"鯽購理房=31虞元FL一人工小時(shí)=方法的重新認(rèn)證可能需要2周時(shí)間，花費(fèi)4000美元。在我們的例子中，在約500次分析運(yùn)行之后，將方法升級(jí)為快速方法在成本上經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。附錄雜質(zhì)分析“ImpurityprofilingwiththeAgilent1200SeriesLCsystem?Part1:StructureElucidationofImpuritieswithLC/MS”,AgilentApplicationNote,publicationnumber5989-5617EN,2006.“ImpurityprofilingwiththeAgilent1200SeriesLCSystem?Part2:IsolationofImpuritieswithPreparativeHPLC”,AgilentApplicationNote,publicationnumber5989-5618EN,2006.“ImpurityprofilingwiththeAgilent1200SeriesLCsystem?Part3:RapidConditionScoutingforMethodDevelopment",AgilentApplicationNote,publicationnumber5989-5619EN,2006.“ImpurityprofilingwiththeAgilent1200SeriesLCSystem,Part4:MethodValidationofUltrafastMethod"AgilentApplicationNote,publicationnumber5989-5620EN,2006.“ImpurityProfilingwiththeAgilent1200SeriesLCSystemPart5:V.QA/QCApplicationExamplewithCompleteSequencing"AgilentApplicationNote,publicationnumber5989-5621EN,2006.行業(yè)指南“GuidanceforIndustryNDAs:ImpuritiesinDrugSubstances,"U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministrationCenterforDrugEvaluationandResearch(CDER)CMC,February2000.“GuidanceforIndustryQ3B(R2)ImpuritiesinNewDrugProducts,"U.S.DepartmentofHealthand