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文檔簡介
抗真菌藥物篩選模型勵飛小組制作目錄1.抗真菌藥物綜述1.1真菌致病特點1.2抗真菌藥物類型1.3抗真菌藥物作用機制2.抗真菌藥物的篩選方法2.1傳統(tǒng)的篩選方法2.2定靶的篩選方法1.抗真菌藥物綜述
1.1真菌致病特點頑固性廣泛性新生性嚴重性1.2抗真菌藥物類型化學合成的抗真菌抗生素
如:咪唑類,三唑類
微生物來源的抗真菌藥物
如:多烯類抗生素1.3抗真菌藥物作用機制作用于真菌細胞膜中醇合成的抗真菌藥物作用于真菌細胞壁合成的抗真菌藥物作用于核酸合成的抗真菌藥物2.抗真菌藥物的篩選方法
2.1傳統(tǒng)的篩選方法選擇毒性小的代表性真菌作為試驗菌,采用管碟法或者紙片法測定樣品對試驗的抑制或殺傷活性。2.1.1管碟法以白色念珠菌為指示菌,對微生物進行篩選。檢測菌的培養(yǎng)基:馬鈴薯培養(yǎng)基:蔗糖1.5%,馬鈴薯2.0%,瓊脂2.0%,pH自然;沙氏培養(yǎng)基:蛋白胨1.0%,氯化鈉0.5%,葡萄糖4.0%,瓊脂2.0%,pH自然。發(fā)酵樣品處理主要用超聲處理,過濾得上清液,經(jīng)過無菌過濾。檢測菌孢子制備
取凍干管中菌接種到沙氏斜面,28oC培養(yǎng);白色念珠菌培養(yǎng)24h,表皮癬菌96h,新型隱球菌48h;
然后分別傳代,培養(yǎng)至子三代;取孢子長勢良好的子斜面1支加入滅菌生理鹽水5ml,用接種環(huán)刮下孢子,轉移至盛有玻璃珠的三角瓶。
同樣方法處理3次,孢子液合并于三角瓶,輕輕震蕩30min,然后過濾得孢子懸液。
取原液和稀釋液兩個濃度的孢子懸液,用血球計數(shù)儀計數(shù),結果分別為3.6×106個/ml、3×106個/ml、5.0×106個/ml.篩選抗真菌活性取無菌平板加底層沙氏培養(yǎng)基20ml,凝固。取制得的單孢子懸液,將合適的菌液加入48oC保溫的100ml沙氏培養(yǎng)基中輕輕搖勻。再取5ml注入底層培養(yǎng)基上,搖勻制成含菌平板。待平板凝固后,取4支無菌鋼杯按等距離排放,一個加入酮康唑對照品,另3個加入受試樣品,于28oC培養(yǎng)3d,觀察抑菌圈。取滅菌的300ul沙氏液體培養(yǎng)基,以每孔50ul的量加入到96孔細胞培養(yǎng)板的個孔中;取50ul樣品溶液分別加入到96孔板的第1行個孔中(從第2列開始留1列作空白對照),每1列從第1行開始依次倍半稀釋到最后一孔(即第8行),然后在28oC培養(yǎng)16~18h,在倒置顯微鏡下觀察孢子生長的菌絲形態(tài),判斷其活性,計算最小活性濃度。2.12紙片法與管碟法類似,用無菌過濾紙片沾取藥物貼在真菌培養(yǎng)基上,觀察菌落情況。傳統(tǒng)方法固然存在許多缺點,但由于操作簡單和處理量大,非常適合微生物發(fā)酵樣品初篩。2.2定靶的篩選方法目前發(fā)現(xiàn)作用于真菌的靶位有三種途徑:真菌結構成分及代謝產(chǎn)物分析;真菌產(chǎn)物的生物合成途徑及其相關酶分子的研究;控制真菌生長和細胞分裂的基因序列分析。2.2.1真菌細胞壁合成抑制劑篩選大多數(shù)真菌細胞壁成分包括:幾丁質,-β葡聚糖,α-葡聚糖和各種甘露聚糖蛋白。2.2.1.1β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑β-1,3葡聚糖是真菌細胞壁的重要成分,但并不出現(xiàn)在人類和其他哺乳動物細胞。因此β-1,3葡聚糖的合成被期望成為篩選特異性抗真菌抗生素的理想靶位。日本Ohayama建立的篩選模型
提取白色念珠菌和煙曲霉的β-1,3葡聚糖作為反應酶,酶反應混合物(100ul含)含有75mmol/LTris-HCl(pH7.5)、0.75mmol/LEDTA、0.75%BSA、1mmol/LUDP-葡萄糖和0.06uCi的UDP-[U-14C]葡萄糖(519mCi/mmol)。在酶反應混合物中加入5ul酶溶液,在30oC培養(yǎng)60min,加入100ml冰冷的20%三氯乙酸溶液終止反應。濾紙過濾獲得沉淀物,先后使用10%的三氯乙酸和95%的乙醇洗滌、風干,加入100ml的液閃試劑,使用液閃儀測定放射活性。計算酶活性,篩選時在酶反應混合物中加入測定樣品。
文獻報道應用這種方法篩選出許多β-1,3葡聚糖合成酶抑制劑化合物如arborcandinsA~F等。2.2.1.2甘露聚糖合成酶抑制劑甘露聚糖是真菌細胞壁組成中三種多糖之一,對細胞壁的功能起到十分重要的作用。甘露聚糖合成酶抑制劑篩選模型
分離啤酒酵母的甘露聚糖合成酶,以[14C]GDP-甘露聚糖為底物。反應混合加入12.5umol/L[14C]GDP-甘露聚糖、20mmol/L二甲基砷酸鹽緩沖液(pH6.5)、10mmol/LMnCl2、1mmol/L二硫蘇糖醇、待測樣品和甘露聚糖合成酶,25oC反應30min,使用紙層析測定多聚物。
普納米星(pradimicin)類和貝娜諾霉素(benanomicin)類在存在Ca2+的條件下,其有力羧基與細胞表面甘露聚糖蛋白質復合物的多糖部分絡合,導致細胞壁結構異常而破裂,細胞膜通透性增加,胞內鉀外漏而致細胞死亡。2.2.1.3幾丁質合成酶抑制劑幾丁質是β-(1,4)糖苷鍵連接的N-乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)的鏈狀聚合物,是細胞壁的支架結構。幾丁質合成酶催化GlcNAc在細胞膜上聚合成幾丁質,在真菌細胞的分裂和成熟中起了重要作用。幾丁質合成酶抑制劑篩選模型
篩選方法類似于甘露聚糖合成酶抑制劑方法。
尼克霉素(nikkomycin)和多氧霉素(polyoxin)是兩類幾丁質合成酶抑制劑,因其結構與幾丁質的前提尿苷二磷酸N-乙酰胺基葡萄糖(UDPNlcNAc)類似而競爭性抑制幾丁質合成酶。2.2.2真菌細胞膜合成抑制劑真菌細胞膜是一種滲透屏障,可作為小分子和信號傳導的通路。細胞膜由磷脂類、鞘脂類和固醇類物質組成,為各種功能蛋白提供基本的骨架。2.2.2.1麥角固醇生物合成抑制劑麥角甾醇是真菌細胞膜的重要結構組分,在真菌生活中其重要作用。一些不同類型的化合物通過作用于真菌麥角甾醇生物合成途徑中不同環(huán)節(jié)的酶,干擾真菌麥角甾醇生物合成,發(fā)揮抗真菌作用。2.2.2.2鞘磷脂合成的抑制劑鞘磷脂是真菌與哺乳動物細胞膜必要成分,借其信號傳導來控制細胞的分裂、增殖和凋亡。鞘磷脂合成始于脂肪酰輔酶A,通常軟脂酰輔酶A與絲氨酸結合,這一過程受絲氨酸軟脂酰轉移酶酯化。針對這一過程,目前有多球殼菌素(myriocin)、脂黃菌素(lipoxarnycin)、鞘脂菌素(sphingoffigins)和綠啶菌素(vindofungins).2.2.3真菌DNA和蛋白質合成抑制劑許多癌癥化療用藥或抗細胞感染系列藥物如:炭疽環(huán)素(a-thracycines)、奎諾酮等均是DNA拓撲異構酶抑制劑。篩選方法類似于抗細菌DNA旋轉酶抑制劑的篩選,主要是從相應試驗菌中提取酶,建立體外反應系統(tǒng),檢測樣品對酶反應的抑制作用高低有無。2
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